sds的作用及煮沸原理.docVIP

根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理. 1、还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离.一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样. 2、带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象.100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺,并在室温保温30min.? 3、非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1％SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用.SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。SDS不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。? DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT价格略高一些。DTT有两个巯基集团，巯基乙醇只有一个巯基集团。 就因上述原因使得1个蛋白做非还原电泳和还原电泳所跑的迁移率不同。 100度加热的目的就是蛋白变性，并且和sds进行充分的结合，是为了破坏蛋白质的高级结构.煮过的蛋白跑胶就不会受到它本身高级结构的影响,只和大小相关.不煮的话,跑胶的速率就与很多其他因素相关,特别是高级结构.不加热可以电泳但是效果不好。 SDS的结构决定了它可破坏蛋白质的疏水作用（该作用对维持蛋白三级和四级结构相当重要），SDS：十二烷基磺酸钠，十二烷基部分是疏水结构，而磺酸钠部分是亲水或极性结构。SDS的疏水结构可插入蛋白质的疏水内部（通常水溶性的蛋白质，其疏水氨基酸残基埋藏在蛋白内部，亲水氨基酸残基位于分子表面），这样，SDS就破坏了蛋白的疏水作用，从而破坏蛋白的三级或四级结构，引起变性。 煮沸是让蛋白质变性，正常的SDS，在SDS、还原剂和煮沸的作用下，蛋白质的二级三级结构都被破坏，二硫键也被打开，蛋白变为线性，且跟大量SDS结合，SDS的负电荷屏蔽了蛋白本身带的电荷，这样，各种蛋白跑得快慢就只跟分子量大小有关。你的实验中使用的是非还原上样buffer，如果目的蛋白中有二硫键，就无法打开，尤其是没煮过的，可能还保留一定的结构和构象，这样蛋白的迁移率还受蛋白构象影响，跑得稍快可能是跟煮过的相比，其构象更紧密的原因。至于为什么没煮过的更接近真实分子量，那是因为你用的上样buffer是非还原的，连Marker的迁移率也不是只跟分子量相关了。要想准确反映分子量，还是要按标准的SDS操作，使用还原上样buffer，煮沸样品。