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Western blot 转膜及膜的选择 转膜： 经过 PAGE 电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从 PAGE 胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行 Western Blot 的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作 画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。Western Blotting 亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实 验。 Western Blot 印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和 PVDF 膜（Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也有用尼龙膜、DEAE 纤维素膜做蛋白印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜 能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有 其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。 转膜 是对 western blot 最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方面。 首先是膜的选择问题。膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于 20kDa 的小蛋白，0.45um 的 NC 膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非 PVDF 膜不可，因为只有 PVDF 膜才能经受住严酷的清洗条件。常用的 western blot 用膜有 NC 膜、PVDF 膜和尼龙膜，它们的一些主要的特点总结如下表： NC 膜 尼龙膜 PVDF 膜 灵敏度和分辨 高 高 高 率 背景 低 较高 低 结合能力 80－110 ug/cm2 400 ug/cm2 125－200 ug/cm2（适合于 SDS 存在下与蛋白质的结合） 材料质地 干的 NC 膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有 操作程序 缓冲液润湿,避免气泡 缓冲液润湿 使用前 100%甲醇润湿 常规染色，可用放射性和非 不能用阴离子 常规染色， 比较于 NC 膜，可 检测方式 用考马斯亮蓝染色，可用于 ECL 放射性检测 染料 检测，快速免疫检测。 0.45um 一般蛋白 低浓度小分子 0.2um 一分子量小于 20kD 蛋白、酸性蛋 适用范围 蛋白 白、糖蛋白和蛋 糖蛋白检测和蛋白质测序 0.1um 一分子量小于 7kD 蛋 白多糖(主要用 白 在核酸检测中) 价格 价格较便宜 便宜 较贵 其次是转膜方法的选择。主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求高，但效率也高。湿法操作要求相对低，花时间多一些。 最后是实验操作方面的问题。使用 PVDF 膜的时候需要进行预处理，这里面会带来一些问题，如甲醇润湿不够，膜的有些区域不能很好的结合蛋白就会引入误差。膜上面一定不要有油脂类的东西，否则也会影响蛋白结合和抗体的杂交。 硝酸纤维素膜 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol 类）、常规显色、 染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC 膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以 了；比如 NC 膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到 NC 膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间， Schleicher Schull 公司的一个实验表明，转移到 NC 膜上的几种蛋白 4 度条件下保存 5 年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的 Western Blot 结果。不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要 注意的是选择合适的孔径，通常 20KD 以上的大分子蛋白用 0.45um 孔径的膜，小于 20KD 的话建议选择 0.2um 的，如果小于 7KD 的话最好选择 0.1um 的膜。另外还要注意选择纯的 NC 膜——混有 含醋酸纤维（CM）的 NC 膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于 NC 膜上结合的蛋白会因为一些去污 剂而被代替，因此在封闭时最好使用较