蛋白质双向电泳简介模板.ppt

第二向 SDS? 若分离的蛋白质一旦被还原、烷基化和 SDS 饱和 , 将 它们转移至第二向是相对简单的事情。平衡后的 IPG 胶可以被 水平或垂直 放在 SDS胶上 , 用 0.8% 低 熔点琼脂糖封胶 , 固定 IPG 胶 , 以防电泳时滑动或漂移。 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的 低电流（ 5mA/gel/17cm ）或低电压，待样品在完全 走出 IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电 压）（ 20-30mA/gel/17cm ），待溴酚蓝指示剂达到 底部边缘时即可停止电泳。根据 IPG 胶的长度 , 可以制 备不同长宽的 SDS胶 , 从微型胶大约 7X8cm 或 13X9cm 直到大胶 25X20cm 。各种大小的预制胶可以 在一些公司买到。一般来说 , 胶愈大 , 分辨率更好 , 能够 运载蛋白质的量也愈多。 使被分离的 蛋白质与 SDS 完整结合 第二向 : SDS? SDS 平衡 ? SDSSDS 平衡液 50 mM Tris-HCl 6 M 尿素 30% 丙三醇 2% SDS 微量 溴酚蓝 S D S SDSSDS向电泳缓冲液中加 0.5% 的琼脂糖 SDS标记纸片 IPG 胶条 蛋白质双向电泳 简介 ? 双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术 , 具有简便、 快速、高分辨率和重复性等优点。 1975 年 , 意大利生 化学家 O.Farrell 发明了双向电泳技术 , 大大提高了蛋白 质分离的分辨率而得以广泛应用 , 至今已经历了快四十 年的发展 , 双向电泳技术已较为成熟 , 但在基本技术上 仍未改变。双向电泳技术包括蛋白样品制备、干胶条 水合、等电聚焦、在平衡液中平衡胶条和 SDS电泳等步骤。双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分 子量大小的差异 , 通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群 的技术 蛋白质组学（ proteomics ） ? 概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变 化的一门科学 ? 研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、 修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最 终确定它们的功能 仪器设备 原理 ? 双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大 小的差异 , 通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质 群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理 化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质 的等电点不同 , 通过等电聚焦将带不同净电荷 的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 它依据蛋白质分子 量的不同将之分离。 ? IPG 干胶 pH 梯度是通过缓冲复合物与聚丙烯酰胺凝胶 共价结合形成的 , 随着凝胶聚合而将 pH 梯度固定。即 使胶条在高电压下进行较长时间的等电聚焦 , 仍保持稳 定的 pH 梯度。这是高分辨分离所必需的。 IPG 胶灌注 在塑料片上 , 然后盖上相同大小的塑料片 , 机械切割成 固定大小而易操作的干胶条。第二向电泳分离的重现 性有明显提高 , 主要是因为使用了预制的 SDS胶和灌制多板胶的设备 , 实现了实验系统的标准化 , 便 于实验室内部及实验室之间数据比较和合作。 要用到的试剂 ? 样品裂解液 : 7mol/L 尿素 ,4% CHAPS,10mmol/LTris,2mol/L 硫脲。 ? IPG 溶胀液 : 8mol/L 尿素 ,2%CHAPS, 分装成 0.5ml/ 管 ,-20 o C 保存。 使用前 2.5ml IPG 溶胀液加入 7mg DTT,0.5%IPG 缓冲液 (3~10L), 少 量溴酚蓝。 ? 平衡液 : 50mmol/LTris-HCl (pH8.8),6 mol/L 尿素 ,30% 甘油 ,2% SDS, 少量溴酚蓝。使用前 10ml 平衡液加入 0.1mgDTT 。 ? 溴酚蓝溶液 :1% 溴酚蓝 ,50mmol/LTris-HCl, 分装成 0.5ml/ 管 ,-20 o C 保存。 ? 30% 丙烯酰胺贮存液 : 30% 丙烯酰胺 ,0.8% 甲叉双丙烯酰胺 ,0.45um 微孔滤膜过滤后 , 避光贮存于棕色瓶中 4 度保存。 ? 凝胶缓冲液储存液： 1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8),0.45um 微孔滤膜 过滤后 ,4 度保存。 ? SDS 电泳缓冲液 :25mmol/L Tris-HCl (pH8.3),192mmol/L 甘氨 酸 ,0.1%SDS 管状胶条的制备 : ? 去离子水 2.1ml ? 30% 丙烯酰胺 0.8ml ? 两性电解质 280ul ? 尿素 3.15g, 水浴使 尿素溶解。 ? 20%NP- 40 0.3ml ? 10% 过硫酸铵 20