蛋白质的通性纯化和表征.pptVIP

第 3 章 蛋白质的通性、纯化和表征 一、 蛋白质的酸碱性质和等电点 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。 ? 等电点：蛋白质所带净电荷为零的 pH 值称为等电点。 ? 在等电点 时 ，蛋白质 在电场中不移动 , 溶解度最小，粘度 最大。可以用溶解度法，聚焦电泳法等测定等电点。 二、 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质分子直径在 1-100nm 之间，在水溶液中具有胶体溶液 的通性。 1 、 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素： ①蛋白质表面极性基团形成的 水化膜 将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀； ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，构成稳定的 双电 层 ，互相排斥不致聚集沉淀。 ? 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应 用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 ? 一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从 溶液中析出沉淀。 2 、 沉淀蛋白质的方法 ①盐析法 : 大量的中性盐（（ NH 4 ） 2 SO 4 、 Na 2 SO 4 、 NaCl ），使蛋白质脱去 水化层而聚集沉淀；不引起变性。 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等； ③重金属盐沉淀： pH ＞ pI 时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（ Hg 2+ . Pb 2+ . Cu 2+ 等）结成不溶性沉淀； ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法： pH 小于 pI 时，蛋白质带正电荷，易与生物 碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、 钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸； ⑤加热变性沉淀法。 三、蛋白质分离纯化的一般原则 ? 纯化的实质：增加制品的纯度或比活性 ? 一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶保 存 电泳 前 处 理 粗 分 离 细 分 离 生物组织 无细胞提取液 破碎、溶 解、差速离心 选择性沉淀法 亲和 层析 离子交 换层析 精制后的蛋白质 凝胶 过滤 疏水 层析 吸附 层析 1 、前处理（ pretreatment ）： ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机 、匀浆器、超声波处理； 植物组织和细胞：石英砂 + 提取液研磨或用纤维素酶处理； 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖） ②如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组 分（表 7 － 5 ）； ③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。 2 、粗分级分离（ rough fractionation) 一般用选择性沉淀法。 ①（ NH 4 ） 2 SO 4 分级沉淀法（盐析） ②等电点选择性沉淀法 ③有机溶剂分级沉淀法 3 、细分级分离（ fine fractionation) ) ★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲 和层析、疏水层析（反相 HPLC ） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和 薄膜电泳等）、等电聚焦、双向电泳 ★密度梯度离心 4 、结晶（晶体保存） 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个 指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越 容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、 调节 pH 。 四、 蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小的差异 透析法：将样品装在 透析袋里，半透膜 阻留 pr 分子，而让 小的溶质分子和水 通过，以达到除去 蛋白质溶液中小分 子（盐、低分子酸 等）。 ①透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透 膜 的性质除去样品中的小分子非蛋白物质 超过滤法：施以一定的压力强迫 小分子物质通过半透膜，而 按半透膜的筛孔大小截留相 应的蛋白质分子。 ②凝胶过滤法（分子筛层析法） 凝胶过滤常用的介质 ： 在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒。 交联葡聚糖（ Sephadex ，是由葡聚糖与环氧氯