6在制备感受态大肠杆菌及转化过程中.pptVIP

实验 26 质粒转化大肠杆菌 目 的 1 ．重组质粒的鉴定 当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的 重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把 重组成功的质粒找出来。 在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗 性基因，一旦重组成功，或者不含插入片段的质粒自身环 化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗 相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传 代。不然，假如重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素 而死亡。 2 ．为扩增质粒和其它载体作准备 由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需 要 20-30 分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到 几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可 以在短时内极大地扩增目的质粒。 * 作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过 的工程菌。 原 理 本实验通过 CaCl 2 对特定的大肠杆菌处理， 制备感受 态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒 DNA ，如一些 6 7 插入目的 DNA 片段的重组质粒，产生 5 × 10 -2 × 10 个转 化的菌落。 当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆 菌的表面，在 42 ℃的温度时，大肠杆菌出现 热休克 ，质 粒可通过 大肠杆菌细胞膜上形成的空隙 进入菌体内。随 后，加入 LB 培养液，于 37 ℃振动培养可使细菌复苏，并 且 表达质粒编码的抗生素抗性基因 ， 提高转化效率。 转化 成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代， 形成菌 落。 实验准备 （参考教材） 实验结果 转化成功， 培养皿中可见散在的菌落， 其中加入 100ul 培养液的培养皿中的菌落数约为 50ul 培养液培养皿的一 倍。 转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后 者提示可能是抗生素浓度不够或失效。 实验步骤 自 -70 ℃ 冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶 解约 5-15 分钟，轻轻混匀。吸取 50ul 移入 1.5ml 管，并 立刻将细菌放回 -70 ℃冰箱。 细菌 50 ul DNA 5 ul 轻轻混匀，静置冰上 30 分钟。 于 42 ℃水浴中热休克细菌 45-60 秒，迅速移入湿冰 中，静置 2 分钟，加入 900ul LB 培养液，放入 37 ℃恒温 箱摇床， 225rpm 摇晃培养 1 小时。分别取 50ul 和 100ul 涂于两只含氨卞青霉素的 LB 琼脂平板皿上， 待干燥后， 倒 置，存放于 37 ℃的培养箱中过夜。 次日，检查各培养皿中是否出现菌落。 1. 无菌落， 失败。 或培养条件不充 分。 2. 菌落布满如苔 样，失败，可能 是抗生素浓度不 够或失效。 3. 菌落布满，浓 度太高，失败。 4. 出现菌落，符 合要求。 注意事项 1 ．本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，因而 采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基因还有四环 素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗生素板。 2 ．整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于琼脂 板含有抗生素，所以当实验环境干净者，可以直接放在普通 实验台上操作。 3 ．接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须冷后 方可涂皿。对于那些缺少实验室经验的研究人员，我们建议 采用成 L 型的自制玻璃涂棒，这样由于 L 型的下端与琼脂板 的接触面大，不易将琼脂板划破。 4 ．培养皿在皿底作标记，写明内容、日期、操作者等， 倒置放入培养箱。 5 ． 感受态大肠杆菌的制备： （ 1 ）在无污染的条件下，用 LB 扩增大肠杆菌，并离心 收集。 （ 2 ） 4 ℃条件下，用 0.1 mol/L CaCl 2 重悬沉淀，再离 心沉淀，以洗去 LB 培养液。 （ 3 ） 4 ℃条件下，用 0.1 mol/L CaCl 2 重悬沉淀，分装 备用。 大约 50ml 的 LB 培养液的大肠杆菌， 溶于 2ml 的 CaCl 2 8 中（每 ml LB 培养液大约含 10 成活的大肠杆菌， LB 培养的 菌落要求划皿约 16-20 小时的菌落） 。 6 ．在制备感受态大肠杆菌及转化过程中，尽量不使用玻 璃器皿，以免降低转化效率； 7 ．使用新鲜制备的感受态大肠杆菌，有利于提高转化效 率； 8 ．在整个实验过程中，要注意冰上操作。