血清总蛋白测定(双缩脲试剂法).docxVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 1 ???????????????????????医 料推荐??????????????????? 实验名称 血清总蛋白测定（双缩脲试剂法） 实验日期 2014-11-21 实验地点 第五实验室 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 一、实验目的 1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 2、熟悉血清总蛋白的临床意义； 3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 （一）：双缩脲反应 在碱性溶液中 , 双缩脲 (H2NOC － NH－ CONH2) 能与 Cu2+作用 , 形成紫色或紫红色 的 络合 物 , 这 个反 应叫 做双 缩脲 反应 。 两分 子尿 素加 热脱 氨缩 合成 的双 缩脲 H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与 Cu2+发生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物 ；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（ -CO-NH-），同样能在碱性条件下与 Cu2+发生双缩脲反应 ，生成的紫红色络合物 ，且在 540nm处的吸光度与蛋白质的含量在 10～120g/L 范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 实验材料 样品：大牛血清 试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（ 70g/L ）、生理盐水（ 0.9%） 器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球 设备： 1100 分光光度计、水浴锅 2 ???????????????????????医 料推荐??????????????????? 实验步骤 取 3 支试管，做好标记 (B 空白对照， S 标准液， U为待测大牛血清 ) ，按下表操作： 加入物（ ml） B ( 空白） S （标准） U（待测） 大牛血清（ 1：10） - - 0.5 蛋白标准液（ 1：10） - 0.5 - 0.9%氯化钠溶液 0.5 - - 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 各管混匀，观察各试管颜色 将各试管置于 37℃水浴锅中加热 20min，观察颜色 将试管中的液体倒入比色杯中， 置于 1100 分光光度计的样品槽内， 在波长 540nm，以空白管调零，测 S 和 U 管吸的光度。 测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管 依据公式算出结果 四、结果与讨论： （一）：实验结果 1、实验现象： a、在实验中首先加入双缩脲试剂，再依次加入 0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应 的大牛血清后溶液没有明显的颜色变化，呈淡蓝色透明状； 3 ???????????????????????医 料推荐??????????????????? b、水浴 20 分钟之后， B 试管试管显淡蓝色； S 试管和 U 试管显浅紫色且 S 试管的颜色 比 U 试管的颜色稍深。 2、实验数据： 管号 测定次数 平均吸光度 1 2 3 S 0.187 0.188 0.187 0.1873 U 0.120 0.119 0.119 0.1193 3、结果计算： 将大牛血清和蛋白标准液的平均吸光度带入公式：血清总蛋白（ g/L)=(Au/As)X 蛋白质 标准液浓度（ g/L), 得出结果：血清总蛋白 =44.586g/L （二）：结果讨论 查阅资料得知，大牛血清总蛋白含量一般为 60-80g/L, 可是，实验结果却是 44.586g/L, 即使按照实验要求及步骤操作 , 结果还是出现了比较大的误差，实验结果经 过讨论，分析如下： 1、成功的方面： a. 在本次试验出现了预期的结果： S 和 U 试管溶液显淡紫色， B 试管显淡蓝色。 S 和 U 试管显淡紫色是因为蛋白质发生了双缩脲反应，但是由于蛋白质的含量偏少显色较浅， B 试管显浅蓝色的原因是 B 试管中没有发生任何反应，显双缩脲试剂的淡蓝色。 水浴，吸光度测试等环节都能够按照预定的步骤进行，操作比较严谨。 2、误差分析： 所测得的蛋白质含量偏低，可能是由于样品存储不当，造成待测的大牛蛋白水解，待测样品中的蛋白质总量本身就很低 待测的大牛蛋白溶液正常，但是，标准蛋白溶液的浓度比标示的高，造成测量结果偏 4 ???????????????????????医 料推荐??????????????????? 低 操作过程有偏差，由于量取蛋白质溶液的量比较少，在每个加样步骤的少量偏差，都会造成结果误差较大 五：结论 样品的蛋白质含量偏低 复习思考题 什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？双缩脲试剂 试剂配制过程中，为何 NaOH要单独配制，最后加入？ 简述血清总蛋白测定的临床意义。 5