清除自由基研究方法汇总.pdf

电子自旋共振法（ ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂 ，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机 · 体的损伤。 目前常用超氧阴离子自由基体系（ O2- ）、羟基自由基体系（· OH ）、 二苯代苦味酰基自由基体系 （DPPH ·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行 了研究。 其中 ESR法和气相色谱法、 HPLC 法对自由基的检测灵敏度高， 但对设备 要求较高， 操作复杂， 无法在一般实验室普及。 而其中的 分光光度法、 化学发光 法、荧光分析法等 不需要昂贵的仪器， 易于被一般实验室所采用， 但测定过程中 的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。 分光光度法最常用。 原理部分： 1.DPPH ·法测试机理 DPPH·（二苯代苦味脐基自由基） 的甲醇溶液呈深紫色， 可见光区最大吸收 峰为 492nm。当自由基清除剂加入到 DPPH ·溶液中时， DPPH ·的单电子被配 对而使其颜色变浅， 在最大吸收波长处的吸光度减少， 而且颜色变浅的程度与配 电子数成化学计量关系， 因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的 情况。 2. 羟基自由基（· OH ） 1）邻二氮菲法 [70] 实验原理：邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在 510nm 处有最大 吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂， 其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状 态的改变。 H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基， 邻二氮菲－ Fe2+ 水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－ Fe3+后，其 510nm 最大吸收峰消失。 如果 反应体系中同时存在羟自由基清除剂， 则 Fenton 反应产生的羟自由基将被此清 除剂全部或部分清除， 邻二氮菲－ Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。 根据这 一原理，可建立以 A510 变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定 法。 2 ）水杨酸法 [71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸 捕集 Fenton 反应体系中的 OH· ，生成的 2,3 －二羟基苯甲酸用乙醚萃取， 用钨酸 钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在 510nm 处的吸光值，此吸光值 可反映体系中的羟自由基浓度。 3 ）甲基紫 -Fe2+-H2O2 反应体系 测定原理：在 Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下： + + - →Fe Fe2 +H2 O2 3 +OH + OH· 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色 [9],在 578nm 处有强吸收。 反应产生的· OH 具有高的反应活性， 容易进攻高电子云密度点， 会与甲基紫中具有高电子云密度 的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在 578nm 处 吸光度值的变化可间接测定出· OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时， 会阻断甲基紫与· OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，