核糖体展示技术.docVIP

核糖体展示技术（Ribosome Display Technology, RDT）是由PlUckthun实验室在多聚核糖体 展示技术的基础上改进而来的…种利用功能性蛋白相互作用进行筛选的新技术，它将正确折 吾的蛋白及其mRNA同时结合在核糖体上，形成mRNA-核糖体■蛋白质三聚体，使H的蛋 白的基因世和表型联系起来，可用于抗体及蛋片质文库选择、蛋H质体外改造等。运用此技 术已成功筛选到一些与靶分了特异结合的高亲和力蛋白质，包括抗体、多肽、酶等，是 蛋白质筛选的重要丁?具。编辑木段原理 核糖体展示技术通过聚合酶链反应（PCR）扩 增DNA文库，同时引入T7启动了、核糖体结合位点及茎?环结构，将其转录成mRNA, 在无细胞翻译系统屮进行翻译，使忖的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成mRNA- 核糖体?蛋白质”复合物，构成核糖体展示的蛋白文库，然示用相戚的抗原从翻译混合物 屮进行筛选，以乙二胺四乙酸（EDTA）解离结介的核糖体复介物或以特异抗原洗脱整 个复合物，并从屮分离mRNA。通过反转录聚合酶链反应（RT? PCR）提供下一轮展示的 模板，所得DNA进入下-轮富集，部分DNA可通过克隆进行测序分析等。 为了 使基因片段能有效转录和翻译,5端应接上T7启动子序列和SD序列，去掉3’端的终止密 码了，从而成功地使核糖体停留在mRNA3‘末端，将蛋H质和mRNA连接在一起。在对基因 片段改造时，常进行多次延伸PCR： ①分别将需要的基因片段和间隔序列备自扩出来 ②用引物4和引物5做连接PCR将目的基因和间隔了连接起来，引物5含有SD序列, 引物4含有3端茎环结构序列。 ③PCR产物再进行延伸PCR,引物6含有T7启动子 序列和5’端茎环结构序列,下游产物同前。报后得到的PCR产物,5’端接上T7启动子和茎 环结构以及SD序列,3’端则融合了间隔序列并含有3端的茎环结构 体外转录和翻译 1）体外表达可以利用来H原核的E.coliS30无细胞蛋白质合成系统，或真核的兔网织红 细胞裂解液和麦胚提取物的蛋H质合成系统，至于何种系统更适合,日前尚有争议?体外转录 与体外翻译可以偶联进行，也可以分别进行.日前，己有以DNA为模板的体外蛋白翻译系统和 以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世。 对于含二硫桥的ScFv抗体和 其他蛋白质，转录和翻译应分别进行，因为含有二硫桥的蛋白质要在氧化条件下才能正确折穂, 但转录时,T7 RNA聚合酶要求具还原性的B ■筑基乙醇维持其稳定性。如果目标蛋白在还原 性条件下能正确折叠，则体外转录/翻译偶联体系效果可能更好2）若分别进行,则需要 控制RNase的影响.VRC—过渡态类似物一作为RNase抑制剂，能有效抑制核酸酶，提高E.coli 核糖体展示效率。翻译结束示立即冷却反应混合物，所有筛选步骤在冰上进行降低RNase的 影响。另外,3’端和5’端的茎环结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseII和核酸内切 酶RNase E的影响。 亲和筛选 体外翻译反应结朿后，将翻译混合物稀释4倍终止反应。反应试剂屮始终保持5 mmol/L Mg2+浓度，稳定mRNA-核糖体?蛋白质三元复合体。可以直接用于筛选实验，也可以于4°C 保存，核糖体复合物在4°C至少可以稳定10d,但产量会逐渐减少。体外筛选时加入1%?2% 脱脂奶粉和0.2%肝素可以降低抗原■抗体的菲特异性反应，肝素还能抑制核酸酶。 ①亲 和筛选 分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和磁珠法。Hanes等认为,ELISA方法 屮，抗原包被在頼料表面上，而敎料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象，从 而导致筛选出的抗体分了不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上连接捕获标签，如生 物素，然麻在形成抗原?抗体复合物示，采川磁珠?链霉亲和素捕获该标签，进行亲和筛选。 ②mRNA的分离 筛选完后，加入含20 mmol/LEDTA的冰冷缓冲液洗脱mRNA。洗脱 下来的mRNA用DNase I处理去除残留的DNA模板，进行RT-PCR反应重新引入T7启动 子，SD序列等核糖体展示必需元件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交，评价筛选效 率。将最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接,转化到大肠杆菌屮，可以得到单个靶标克隆。 进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体型)表达方式表达单链抗体分了，进行活性鉴定。 体外分子定向进化 川核糖体展示技术对未变异的文库进行筛选时,可以通过易错PCR或(DNA shuffering) 等方法引入突变和重组技术，增加分了多样性，从而提高获得高亲和力、良好稳定性或增加酶 活性靶标分了的机率.PlUckthumx小纟fl利用核糖体展示技术筛选到1.1 nmol高亲和力的ScFv, Z后通过引入DNA重排技术，乂将其亲和力