14基因重组与基因工程一DNA重组技术二分子杂交技术三转基因.ppt

（ 1 ）转基因动物 1982 年，人们 将 大白鼠的生长激素 基因放在质粒中小 白鼠金属巯基蛋白 启动子之后 。 将重组好的这种 质粒，用特制的微 量注射器注入小鼠 受精卵的雄性原细 胞核中，再将这个 受精卵植入小鼠子 宫中。 启动子 结果 为发育成 熟的小鼠体重比 对照小鼠大两倍， 成为“硕鼠”或 “超级鼠”。 1986 年，美国制备 出 转生长激素基因 的 猪 。这种猪生长快， 饲料转换率和瘦肉率 显著提高而肥膘低， 与注射生长激素的效 果相同。 我国现制备出转基 因猪、羊、兔等。 然而， 转生长激素基 因的猪 生殖能力明显 下降，不能繁殖扩群。 五、基因重组与基因工程 （一） 重组 DNA 技术的基础 （二） 重组 DNA 技术的基本操作过程 （三） 重组 DNA 技术的应用 （一）重组 DNA 技术的基础 重组 DNA 技术的定义 在体外，将一种外源 DNA 和载体 DNA 重新组合连 接，形成杂交 DNA ，然后将其转入宿主细胞，最终 使外源 DNA 在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而增 殖和表达 , 从而改变生物原有遗传性状的过程，称 为 重组 DNA 技术 。 它是按生物科学规律，在体外人为的改造基因， 最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又称为 “ 遗传工程 ” ，亦即“ 基因工程 ” 。 1. 重组 DNA 技术的基础 ( 1) 重要的工具酶 (2) 载体 （ 1 ）重要的工具酶 ① 限制性内切酶 它能够 识别 、 切割 双链 DNA 分子中的特定 序列，这些特定序列多数为反向重复序列， 一般长度是 4 、 5 或 6bp 。 ① 粘性末端 如 EcoR I: 5 --- GAATTC CTTAAG --- 3 ② 平齐末端 如 HaeIII: 5 --- GGCC CCGG --- 3 Eco R1 限制性酶酶切 P GAATTC Q P CTTAAG Q X GAATTC Y X CTTAAG Y 片段退火与 DNA 连接酶连接 P G P CTTAA AATTC Q G Q X G X CTTAA AATTC Y G Y P G AATTC Y G Y X G AATTC Q G Q P CTTAA X CTTAA ② DNA 连接酶 目前使用的连接酶有两种： 大肠杆菌 DNA 连接酶 黏性末端连接； T 4 连接酶 黏性和平齐末端连接。 （ 2 ）载体 概 念 能将外源 DNA 带入宿主细胞，进行复制扩 增或最终使外源基因得以表达的自主 DNA ， 称为 载体（ vector ） 。 分 类 ① 克隆载体 用于基因的复制、扩增、 测序等； ② 表达载体 用于目的基因的表达。 （二）重组 DNA 技术的基本操作过程 1. 目的基因的获得 2. 选择和制备载体 3. 将目的基因与载体进行切割连接 4. 将重组体导入受体细胞 5. 阳性克隆的筛选和鉴定 6.DNA 重组体的扩增、表达等研究 重 组 技 术 的 基 本 操 作 过 程 DNA 1. 目的基因的获得 （ 1 ）提取 DNA 后， PCR 体外特异扩增 （ 2 ）以 mRNA 为模板，反转录合成 cDNA 。 （ 3 ）化学合成基因 （ 4 ）限制性内切酶从载体上切取 （ 5 ）构建基因文库，调取目的基因 2. 载体的选择和制备 原核生物常用的载体： 质粒和噬菌体； 真核生物常用的载体： 动物病毒、酵母； 穿梭载体： 通常是指那些既能在真核细胞 中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。 3. 目 的 基 因 与 载 体 的 酶 切 与 连 接 4. 重组 DNA 导入宿主细胞 转染 -------- 转化 大肠杆菌、酵母、真菌及各 种真核细胞、受精卵细胞都 可用于重组。 5. 目的基因的筛选和鉴定 （ 1 ）遗传学方法 （ 2 ）核酸杂交法 （ 3 ） PCR 方法 （ 4 ）酶切鉴定 （ 1 ）遗传学方法 利用载体的特殊标记 如质粒含有 抗青 霉素的基因 ，当含外源 DNA 的质粒转化后可 在含有青霉素的培养基中生长，而未转入 质粒的细菌在同样的条件下不能生长。 （ 2 ）核酸杂交法 2 6 菌落原位杂交 3 2 6 （ 3 ）多聚酶链式反应 20 世纪 80 年代末发展起来的一种 DNA 特定片段 体外快速合成扩增 的方法，称 多聚酶链式反应 （ polymerase chain reaction ， PCR ）。 PCR 技 术具有高度的灵敏性和特异性，能在极短的时 间内将目的基因扩增至数百万倍，通过 琼脂糖 凝胶电泳 ，可以直接观察产物的存在。因此， PCR 技术对于鉴定阳性克隆十分有效，而且无需 制备 DNA 。 （ 4 ） 酶切鉴定 6. 目 的 基 因 表 达 （三）重组 DNA 技术的应用 1. DNA 指纹技术 2. 转