t细胞表型及脾细胞分离-文档资料.pptVIP

研究生实验 一、 T 细胞表型测定（一） 二、小鼠脾细胞分离技术 潍坊医学院免疫学教研室 邸大林 Tel ： 2608468 Email ： myxwfmc.edu 实验一、 T 细胞表型测定（一） --- 免疫细胞的分离、细胞涂片、固定及保存 原理： T 细胞是一个复杂的，不均一的整体，根据其发育的不同阶 段，表面标记以及功能，可将其分为不同的亚群。 T 细胞介 导细胞免疫应答，并且对 B 细胞介导的体液免疫应答起到 辅助和调节作用。 T 淋巴细胞表面标志 T 细胞共有标志： CD3 + 为总细胞 T 细胞特有标志： CD4 + 细胞为辅助细胞， CD8 + 细胞为杀伤细胞。 正常值： 正常人外周血中： CD3 为 60% ～ 80% ； CD4 为 35% ～ 55% ； CD8 为 20% ～ 30% CD4/CD8 的正常值约 1.4 ～ 2.0 。 CD4 ／ CD8 ＜ 1.4 ： ①免疫缺陷病，如艾滋病的比值常小于 0.5 ； ②恶性肿瘤； ③再生障碍性贫血； ④某些病毒感染。 CD4 ／ CD8 ＞ 2.0 ： 自身免疫性疾病，如 SLE 、类风湿关节炎等。 T 淋巴细胞表面标志的检测，有助于了解机体的细胞免疫功能， 对免疫缺陷病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥 反应等疾病的诊断、分型、预后和疗效观察有着重要的意义。 SABC-AP 法测定 T 细胞亚群 SABC ： 为链酶亲和素－生物素， AP 为碱性磷酸酶。 链酶亲和素： 是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量 60kD ， 每个分子由 4 个亚基组成，可以和 4 个生物素分子结合。亲和素 与生物素一经结合就极为稳定，形成一种类似晶格的复合体。 实验基本流程 二抗 T cell 一抗 待测 T 细胞 CD 分子（？？？） 底物 实验材料 肝素、淋巴细胞分层液、 Hanks 液、 PBS 等； 一次性注射器、试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显 微镜，温箱等。 鼠抗人 CD3 、 CD4 、 CD8 单克隆抗体（ 1 抗）；羊抗鼠 IgG （生 物素化 2 抗）； SABC-AP ；底物（ BCIP/NBT 磷酸甲苯胺蓝盐） 等。 实验步骤 标本的制备：淋巴细胞悬液的制备 标本的染色： 结果的观察： 标本制备：淋巴细胞悬液的制备 （ 1 ）取肝素抗凝血 5ml 与 5ml Hanks 液稀释混匀，每组取 2ml ，用 滴 管 贴 管 壁 轻 轻 叠 加 于 2ml 分 离 液 上 ， 配 平 后 1500rpm 离 心 10mins 。 （ 2 ）洗涤细胞：用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的 淋巴细胞，放入盛有 2ml Hanks 液的试管， 1500rpm 离心 10mins ， 弃上清，将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入 Hanks 液重复洗涤 一次，最后一次用 PBS 洗涤。 下一次实验检测 T 细胞亚群用。 （ 3 ）弃去上清，淋巴细胞沉淀用 200 μlPBS 溶解，取 20 μl 细胞涂片， 标本染色 细胞涂片用记号笔划圈，滴固定液 1 滴，室温固定 2 ～ 3 分钟。 滴加鼠抗人 CD3 、 CD4 、 CD8 抗体 15μL ，轻轻摇晃，使单抗均 匀铺在细胞表面， 37 ℃ 孵育 2 ～ 3h ， PBS 洗 3 次。 滴加生物素标记羊抗小鼠抗体 15μL ， 37 ℃ 孵育 30 ～ 45 分钟， PBS 洗 3 次。 滴加 SABC 15μL ， 37 ℃ 孵育 30 ～ 45 分钟， PBS 洗 3 次。 滴加显色剂 30 ～ 50μL ，室温显色 20 ～ 40 分钟。可在显微镜下 观察，待细胞膜上出现红色标记物时，用 PBS 淋洗。 滴加细胞核复染液 1 滴， 30 秒后自来水淋洗。 显微镜下观察结果。 注意事项： 以上操作中， 37 ℃ 孵育时应将玻片置于湿盒中，切勿干片， 特别是加底物后，干片将导致阴阳性结果不能分辨。 观察结果时应使涂片保持湿润。 观察结果 高倍镜下计数 100 ～ 200 个单个核细胞。计算阳性率。 阳性细胞：细胞表面呈红色。 ①标准阳性： 细胞表面呈红色，可见深蓝色细胞核； ②强阳性： 细胞周缘及中央均呈红色，看不见细胞核； ③弱阳性：