定量westerns：最佳的蛋白印迹标准化方法是什么？.docxVIP

精品 精品 可编辑 可编辑 定量westerns :最佳的蛋白印迹标准化方法是什么? 现代数字检测仪器对于western blotting 不仅仅是检测“有或没有”的技 术，还可以进行western blotting 重复性和定量的检测。 在检测方法的线性动 态范围，对数据进行标准化以控制蛋白上样量和膜转印带来的变化， 可以获得真 正的定量结果。 但是，对蛋白印迹进行标准化的最佳方法是什么？ 过去，金标 准标准化方法是使用看家蛋白，基于这些蛋白在不同实验条件下和细胞系中表达 一致的假设。 然而，最近的研究表明，这种假设并不总是正确的，导致相对蛋 白丰度的测量结果不准确。相反，定量Western blotting 专家和他们发表的期 刊正在推荐一种新的金标准用于标准化 -通过在膜上染色，检测每个泳道的总 蛋白进行标准化分析。 Western blot 标准化：看家蛋白和总蛋白 須悉?用的H迭 ■魁!SHP ?表达水平可能因为真鲨条件的改 ?确保看家蛋白和翳進白灘肢 闕ft保便用的总蛋白杂色兼容F游 使用看家蛋白进行标准化 使用看家蛋白最大缺点是在样品间和不同条件下表达水平可能不一致。 如使 用看家蛋白进行标准化，必须先花费时间和精力来验证蛋白的选择， 并且可能需 要检查多种潜在的标准品，然后才能找到一种在所有样品中真正表达同一水平， 并且在不同实验条件下不会发生变化的标准品。 使用看家蛋白的第二个重大挑战是它们的表达丰度很高， 如果样品中的看家 蛋白表达非常高，这会限制在凝胶上加载的样品量，因为需要保留看家蛋白在线 性检测范围内并且不会使看家蛋白的信号饱和。 如果感兴趣的蛋白不是同样高 度表达，这两种蛋白质不在同一线性检测范围内。 如果您正在进行多重蛋白印迹，例如比较同一蛋白质的磷酸化和非磷酸化形 式，则需要考虑的第三个挑战是从不同物种中产生一抗和二抗的复杂性。 最后，检测的看家蛋白可能干扰感兴趣蛋白的检测。理想情况下，看家蛋白应该与感兴趣蛋白的大小不同，因此这两种蛋白可在印迹上空间分辨。 当实验 在同一印迹上检查多种目的蛋白时，这变得越来越困难。 精品 精品 可编辑 可编辑 精品 精品 0可编辑 0 可编辑 A Halxa ce ll lya te, pg2 4 € @ 10 12GAPDHfiKD^ulpisb?二慟 mane iwaxKoo 1 加 gwm i^aixttoo iwmEsi iaxwM1|r =□ A Halxa ce ll lya te, pg 2 4 € @ 10 12 GAPDH fiKD^ulpisb?二 慟 mane iwaxKoo 1 加 gwm i^aixttoo iwmEsi iaxwM 1 |r =□列鮒| t—! —; ■ ■ ■ ■ 1 1 1! ■阳ME g 阿 4JD e.oc S.K LtUX LW Prn?-ein kaod |LigJ 图1.与常见的看家蛋白相比， AzureRed具有更宽的线性动态范围 单色通道图像 A) AureRed 染色总蛋白 B) Tubulin C ) ^-action 和D) GAPDH。 AzureRed 信号的优 异动态范围与实际加载的蛋白量显示在图像( A )中。使用AzureSpot软件定量来自总蛋白和看家蛋白的 信号，并将得到的值相对于每个样品加载的蛋白量( E)作图。与常见的看家蛋白相比， AzureRed表现出 更强的相关性和更广泛的动态范围。 Raw UoIlmtieFvonmlk Raw UoIlmtie Fvonmlk)rd V^riurE 图2.使用AzureRed荧光蛋白染色法将tubulin条带信号进行总蛋白标准化 使用AzureSpot软件定量tubulin蛋白条带。原始的tubulin条带灰度（蓝色直方图）和总蛋白标准化的条 带灰度（橙色直方图）。使用 AzureRed标准化信号可校正上样误差或膜转印所产生的差异。 使用总蛋白进行标准化 使用总蛋白标准化，不是试图找到可以代表转移到膜上的样品总量的蛋白， 而是直接在膜上测量总蛋白，并且该值在标准化时用作分母。许多总蛋白染色剂 可用于染色凝胶和膜。总蛋白染色提供更宽的动态范围，并且表现出比看家蛋白 更低的可变性和更清楚的数据。 总蛋白标准化比使用看家蛋白质快得多，特别是对于化学发光印迹，因为相 对于剥离和重孵育染色步骤花费较少的时间。 理想情况下，在免疫检测之前或 之后，在膜上进行总蛋白染色。使用一些染色剂如AzureRed Fluoresce nt Total Protein Stain，可以在免疫检测前对印迹进行染色，然后与目的蛋白同时对总 蛋白进行成像（S）。通过这种最简单的工作流程，目的蛋白和总蛋白的图像会自 动对齐。 与使用看家蛋白相比，图像捕获后的分析工作