细菌耐药表型检测方法剖析.pptVIP

细菌耐药表型的检测方法 细菌耐药表型的检测 一、 β - 内酰胺酶的检测 （ 1 ）头孢硝基噻吩显色法（ Nitrocefin ）：制配纸 片 → 灭菌水湿润 → 涂测试菌于纸片上， 10min 观察 纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置 1h 内观 察）。 （ 2 ）酸度法：青霉素 →β - 内酰胺酶水解 → 青霉酸、 pH6.8 以下 → 酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液 pH8.5 ）变为黄色。 （ 3 ）碘测定法： β - 内酰胺酶破坏 β - 内酰胺环，碘与 破坏后的 β - 内酰胺结合，使兰色的淀粉 — 碘复合物 转变成无色。 （ 4 ）仪器测定法： Vitek 、 Microscan 的药物测试卡 中均带有检酶功能。 二、 ESBLS 检测 （ 1 ）纸片扩散初筛：头孢他啶（ 30 μg/ 片） 抑菌圈 ≤ 22mm 头孢噻肟（ 30 μg/ 片）抑菌圈 ≤ 27mm 头孢曲松（ 30 μg/ 片）抑菌圈 ≤ 25mm 氨曲南（ 30 μg/ 片）抑菌圈 ≤ 27mm （ 2 ）肉汤稀释法：上述药物 MIC≥ 2 μg/ml 可 疑为 ESBLS 。（表型确证试验：对 2 个任何 一个药物 MIC ，在加克位维酸比不加克拉维 酸的 MIC 值降低 3 个以上对倍稀释度判为 ESBLS ）。 （ 3 ）双纸片协同确认试验： 头孢他啶（ 30 μg/ 片）与头孢他啶（ 30 μg ） / 克位维 酸（ 10 μg ） 头孢噻肟（ 30 μg/ 片）与头孢噻肟（ 30 μg ） / 克拉维 酸（ 10 μg ）两纸片抑菌圈相比 ≥ 5mm 即为 ESBLS 。 （ 4 ） E-test 法（浓度梯度法）：由瑞典 AB Biodisk 公司研究生产，广洲贝肯公司经销。试条中的三代 头孢菌素或氨曲南的 MIC≥ 2 μg/ml 即可疑为 ESBLS 。 （ 5 ） 仪 器 测 定 法 ： Vitek,microscan 和 BD- PHOEMXTM 微生物分析仪均可测试 ESBLS 。 （ 6 ）利用分子生物学技术（ PCR 、 DNA 探针等） 及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检 测技术可对 ESBLS 做出确诊。 三、 Ampc 酶检测 1. 初筛： （ 1 ）头孢西汀（ 30 μg/ 片）与头孢西汀（ 30 μg ） / 邻氯西林 （ 200 μg ）。后者比前者的抑菌圈 ≥ 5mm 即疑为 Ampc 。 （ 2 ） 5 种纸片筛选：马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与 头孢他啶 / 克拉维酸。如头孢西汀 ≤ 18mm ，对马斯平、泰能 敏感即疑为产 Ampc ，如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈 ≥ 5mm 可能产 ESBLS 。 2. 确认试验（头孢西汀三维水相试验法） AmpC 酶新的检测方法 3. 三维水相试验方法的改进 （ 1 ）将标准菌株 ATCC 25922 按常规药敏纸片 K-B 法操作均 匀涂布于 M-H 平板上。 （ 2 ）在 M-H 平板中心贴一片头孢西汀 (30ug/ 片 ) 纸片，在距 纸片边缘 1cm 处，用无菌手术刀片切 3cm 长度的小槽，将 待测菌株的 6 个菌落接种于槽内 ( 勿溢出槽外 ) ， 35 ℃孵育 18-24h 。 （ 3 ）结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即 AmpC 酶阳性。 ※ 三维水相试验方法的改进 (M-H 平板打孔 [2mm] 扩散法 ). AmpC 酶新的检测方法 4. 质粒型 AmpC 酶三联纸片方法的检测 （ 1 ）将标准菌株 ATCC 25922 按常规药敏纸片 K-B 法 操作均匀涂布于 M-H 平板上。 （ 2 ）在 M-H 平板中心贴一片头孢西汀 (30ug/ 片 ) 纸片， 在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含 20ul ， PH8.0 ， 1M Tris-0.1MEDTA ）。 （ 3 ）另一侧边缘贴有产 AmpC 酶菌的纸片（同上）。 （ 4 ） 35 ℃孵育 18-24h ，如待检菌出现扁平或凹陷的 抑菌环为阳性。 四、金属 β - 内酰胺酶的表型检测方法 1. 头孢他啶 +2- 巯基丙酸法 (CAZ+NCA) （ 1 ）将待测菌株按常规药敏纸片 K-B 法操作均匀涂布于 M-H 平 板上。 （ 2 ）在 M-H 平板上分别贴两片头孢他啶 (30ug/ 片 ) 纸片，纸片 中心相距 2.5cm,