动物微生物应用技术 细菌及细菌类疾病的实验室诊断 细菌的染色方法.pptVIP

动物微生物应用技术 掌握细菌常用标本片的制作及染色方法； 认识革兰氏染色的反应特性； 一、实训目的 二、实训器材 病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。 三、实训内容 （一）细菌标本片的制作 （二）血液推片的制作 （三）常用的细菌染色方法 （四）常用染色液的配制 （五）注意事项 （三）常用的细菌染色方法 （三）常用的细菌染色方法 1.单染法：又叫简单染色法，即只用一种染料进行染色。 （1）美蓝染色法 染色液配制：甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL；乙液：0.01%苛性钾溶液100mL。先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈旧的染色好。 （三）常用的细菌染色方法 1.单染法：又叫简单染色法，即只用一种染料进行染色。 染色方法：在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～3min，水洗，吸水纸轻压吸干或晾干和镜检，结果菌体呈蓝色。 （1）美蓝染色法 （2）瑞氏染色法： 染色液的配制：取瑞氏染料0.1g，纯中性甘油1ml，在研钵中混合研磨，再加入甲醇60ml，使其溶解，装入中性瓶中过夜，次日过滤，盛入棕色瓶中，暗处保存。保存越久，染色越好。 染色方法：细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗，干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈其他颜色。 （2）瑞氏染色法： 2.复染 （三）常用的细菌染色方法 革兰氏染色原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（ G- ）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法（KOH溶解试验和氨基肽酶试验可用作辅助试验）。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 2.复染 （三）常用的细菌染色方法 革兰氏染色原理 G- 的细胞壁中脂类较多，肽聚糖少,用洒精脱脂时，脂类易除去使得细胞壁的孔隙变大，从而使结晶紫染料从细胞壁中洗脱出来，最后用红色的染料复染时而显红色；G+ 的细胞壁含脂类较少，肽聚糖多且交联紧密，酒精作用后肽聚糖收宿，细胞壁的孔隙变小使得结晶紫与碘的复合物不能脱出，经红色染料复染后仍为紫色。 革兰氏染色 染色： 初染（结晶紫） 媒染（碘液） 脱色（酒精） 复染（复红） 滤纸吸干 油镜镜检 safranin Crystal violet * * 涂片 → 干燥 → 固定 → 草酸铵结晶紫染色1min → 水洗干燥 → 碘液媒1min → 水洗干燥 → 95%乙醇脱脂 15~20s → 水洗干燥 → 番红复染1min → 水洗干燥 → 镜检。 革兰式染色流程路线： * * 实训三：细菌标本片制备及染色方法 染色步骤 * （２） （３） （１） （４） １分钟水洗 １分钟水洗 15-３０秒水洗 ３０-60秒水洗吸干 复红复染 95％乙醇脱色 结晶紫初染 卢戈碘液媒染 （1）涂片 → 干燥 → 固定 2 1 * * 固定的目的和方法 使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固 可改变菌体对染料的通透性 加热固定可杀死细菌，比较安全 固定的方法将制成的标本匀速通过火焰三次 * * （2）草酸铵结晶紫染色1min → 水洗干燥 * * 结晶紫初染１分钟 　　　　水　洗 * * （3）碘液媒染1min 水洗 → 干燥 * * 碘液媒染　１分钟 水　洗 （3）碘液媒染1min 水洗 → 干燥 * * 　（4）95%乙醇脱色15～30秒 → 水洗干燥 * * 酒精脱色　３０秒 水　洗 * * 　（4）95%乙醇脱色15～30秒 → 水洗干燥 （5）番红复染30S～1min → 水洗 干燥 → 镜检 * * 番红复染　３０秒 水　洗 * * （5）番红复染30S～1min → 水洗 干燥 → 镜检 做细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。 固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免破坏菌体结构。 每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。 每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。 注意事项： 本次课 就到这里了！ 再见 ！ *