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第三章 核 酸 技 术 ? 核酸的分离和纯化 ? 核酸电泳 ? 染色体 DNA 电泳 ? DNA 限制酶切反应和限制酶谱绘制 ? DNA 的连接 ? PCR 技术 ? 分子杂交技术 ? 核酸序列的测定 第一节 核酸的分离和纯化 一、一般程序 1 、供体的核酸分离 供体细胞培养 收集 ( 菌体 ) 细胞 细胞破碎 分离 总 DNA 分离细胞器 分离 总 RNA 分离 细胞器 DNA RNA poly(A)RNA 特异性 RNA 染色体 DNA ( 组建基因组文库 ) 2 、载体 DNA 分离 载体 DNA 感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型） 分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体 病毒载体 DNA 分离与纯化 破碎细胞 质粒 DNA 分离与纯化 3 、 DNA 片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定 DNA 片段的回收 4 、质量评估 1 ） 凝胶电泳 2 ）光密度值测定 3 ）限制酶切分析 二、细胞裂解 1. 酶法： 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂 使原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶 2) 酵母：蜗牛酶、 Novozyme234 、 glusulase 、 zymolase 等 3) 丝状真菌： Novozyme234 、溶壁酶、纤维素酶 4) 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满 足酶的最佳反应条件。 2. 机械法 1) 压力剪切法： French 压力机，酵母细胞，细菌（芽孢 和 G + 球菌除外） 2) 射击破碎法： Braun 破碎机，搅切器（ blender ），混合 器（ mixer ）， 0.1-0.45mm 玻璃球 3) 固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（ 0.1~0.45mm ） 同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4) 反复冻融法 三、 DNA 的分离与纯化 1 、供体 DNA 的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1) 基因组大小： 染色体 细菌 3300~4200kb 酵母 15,000 kb 果蝇 1.28x10 5 kb 人 3x10 6 kb 植物 2x10 5 ~1x10 8 kb 天花病毒 288 kb 痘病毒 196 kb 质体 几 ~100 以上 kb 线粒体 藻类 线状
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