蛋白质的研究基本试验方法.ppt

SDS? 在浓缩胶运动中， Clˉ 解离度大， Proˉ 解离度居中，甘 aaCOOˉ 解离度小，迁移顺序为（ PH6.8 ） Clˉ Proˉ — COOˉ ，一个 Clˉ 领路， — COOˉ 推动，蛋白在中间 ，这样就起到浓缩的作用了。 ? 由于胶联度小，孔径大， Proˉ 受阻小，因此不同的蛋 白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部 蛋白质处于同一起跑线上。 ? 当蛋白质进入分离胶时，此时 Proˉ ， Clˉ ，甘 aa 离子在 PH8.8 的溶液中， Clˉ 完全电离而很快到达正极，甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白 质分子在分离胶中较为缓慢的移动。 SDS? 由于 Proˉ 在电泳过程中，带负电荷多者迁移快， 反之则慢，这就现了 电荷效应 。由于胶孔径小， 而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子 阻力大，小分子阻力小，起着 分子筛 效应，也 就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷 效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。 SDSSDS? 催化剂：过硫酸铵（ AP ）在隔氧的状态下，最 好现配现用，使用新鲜的。 ? 加速催化剂： TEMED ，四甲基乙二胺。催化剂 的作用是使单体聚合成网状聚合物。 SDSSDS? 上样量：总蛋白量 20-50ug （上样量过 多使电泳条带变形） ? 70V ， 30min ； 110V ，与待分离样品靶蛋 白分子量相适应。 SDSElectrophoresis 转膜（电转移） ? 印迹中常用的固相材料有 NC 膜、尼龙膜、 PVDF 等。 ? PVDF （聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸 附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。 ? 有两种规格： Immobilon-P （ 0.45um ）和 Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa) 。 转膜 ? NC 膜及滤纸的预处理： 剪裁与胶大小一致的 NC 膜，将其浸入 1 ×转移 缓冲液平衡 5 分钟以上。（注意：必须保证 NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中） ? PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约 1-2 分 钟。将其浸入 1 ×转移缓冲液平衡 5 分钟以上。 转膜 ? 缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素 （或 PVDF ）膜上，膜可以与蛋白质通过疏水相 互作用产生不可逆的结合。 ? 有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素 膜夹成 三明治 形状，而后浸入两个平行电极 中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方 向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素 （或 PVDF ）膜上。 转膜 转膜 ? 电流 1mA-2mA/cm 2 ，我们通常 200mA-350mA ，按 照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间 蛋白质研究的基本实验方法 南昌大学基础医学院 生理教研室 邹惟莹 实验研究三个水平 ? 整体水平： 动物模型 ? 细胞水平： 形态、功能 ? 分子水平： 基因、蛋白质 蛋白质的调控 ? 基因序列的变化： ErbB2 ? 染色质水平上基因活化的调节： 染色质的结构（对核酸酶的敏感程度增加） 组蛋白的甲基化（ H3-K9 基因沉默， H3-K4 基因活化） 组蛋白的乙酰化 DNA 的甲基化（ 5%C 甲基化 m 5 C ； 5 端 CpG ） 蛋白质的调控 ? 转录水平的调控 顺式作用元件，反式作用因子（转录因子） ? 转录后的调控 ? 翻译水平的调控 ? 翻译后调控 磷酸化、糖基化、泛素化 ? 定位 蛋白质调控的研究 ? Qualitative model (cyclins) ? Quantitative model (CDK) 蛋白质研究的基本方法 ? 免疫印迹（ Western Blot ） ? 免疫共沉淀（ Co-immunoprecipitation ） ? 染色质免疫共沉淀（ ChIP ） Western Blot ? 免疫印迹（蛋白质印迹） 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。 是在凝胶电泳（高分辨率）和固相免疫测定技 术（高特异性，高灵敏性）基础上发展而来。 Western Blot Western Blot ? A. Sample preparation