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SDS? 在浓缩胶运动中, Clˉ 解离度大, Proˉ 解离度居中,甘 aaCOOˉ 解离度小,迁移顺序为( PH6.8 ) Clˉ Proˉ — COOˉ ,一个 Clˉ 领路, — COOˉ 推动,蛋白在中间 ,这样就起到浓缩的作用了。 ? 由于胶联度小,孔径大, Proˉ 受阻小,因此不同的蛋 白质就浓缩到分离胶之上成层,起浓缩效应,使全部 蛋白质处于同一起跑线上。 ? 当蛋白质进入分离胶时,此时 Proˉ , Clˉ ,甘 aa 离子在 PH8.8 的溶液中, Clˉ 完全电离而很快到达正极,甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质,而到达正极,只有蛋白 质分子在分离胶中较为缓慢的移动。 SDS? 由于 Proˉ 在电泳过程中,带负电荷多者迁移快, 反之则慢,这就现了 电荷效应 。由于胶孔径小, 而且成为一个整体的筛状结构,它们对大分子 阻力大,小分子阻力小,起着 分子筛 效应,也 就是蛋白质在分离胶中,以分子筛效应和电荷 效应而出现迁移率的差异,最终达到彼此分开。 SDSSDS? 催化剂:过硫酸铵( AP )在隔氧的状态下,最 好现配现用,使用新鲜的。 ? 加速催化剂: TEMED ,四甲基乙二胺。催化剂 的作用是使单体聚合成网状聚合物。 SDSSDS? 上样量:总蛋白量 20-50ug (上样量过 多使电泳条带变形) ? 70V , 30min ; 110V ,与待分离样品靶蛋 白分子量相适应。 SDSElectrophoresis 转膜(电转移) ? 印迹中常用的固相材料有 NC 膜、尼龙膜、 PVDF 等。 ? PVDF (聚偏二氟乙烯),其具有更好的蛋白吸 附、物理强度,以及具有更好的化学兼容性。 ? 有两种规格: Immobilon-P ( 0.45um )和 Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa) 。 转膜 ? NC 膜及滤纸的预处理: 剪裁与胶大小一致的 NC 膜,将其浸入 1 ×转移 缓冲液平衡 5 分钟以上。(注意:必须保证 NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中) ? PVDF 膜的预处理: 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中,约 1-2 分 钟。将其浸入 1 ×转移缓冲液平衡 5 分钟以上。 转膜 ? 缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素 (或 PVDF )膜上,膜可以与蛋白质通过疏水相 互作用产生不可逆的结合。 ? 有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素 膜夹成 三明治 形状,而后浸入两个平行电极 中间的缓冲液中进行电泳,选择适当的电泳方 向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素 (或 PVDF )膜上。 转膜 转膜 ? 电流 1mA-2mA/cm 2 ,我们通常 200mA-350mA ,按 照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间 蛋白质研究的基本实验方法 南昌大学基础医学院 生理教研室 邹惟莹 实验研究三个水平 ? 整体水平: 动物模型 ? 细胞水平: 形态、功能 ? 分子水平: 基因、蛋白质 蛋白质的调控 ? 基因序列的变化: ErbB2 ? 染色质水平上基因活化的调节: 染色质的结构(对核酸酶的敏感程度增加) 组蛋白的甲基化( H3-K9 基因沉默, H3-K4 基因活化) 组蛋白的乙酰化 DNA 的甲基化( 5%C 甲基化 m 5 C ; 5 端 CpG ) 蛋白质的调控 ? 转录水平的调控 顺式作用元件,反式作用因子(转录因子) ? 转录后的调控 ? 翻译水平的调控 ? 翻译后调控 磷酸化、糖基化、泛素化 ? 定位 蛋白质调控的研究 ? Qualitative model (cyclins) ? Quantitative model (CDK) 蛋白质研究的基本方法 ? 免疫印迹( Western Blot ) ? 免疫共沉淀( Co-immunoprecipitation ) ? 染色质免疫共沉淀( ChIP ) Western Blot ? 免疫印迹(蛋白质印迹) 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。 是在凝胶电泳(高分辨率)和固相免疫测定技 术(高特异性,高灵敏性)基础上发展而来。 Western Blot Western Blot ? A. Sample preparation
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