试验七蔗糖酶的制备和活力测定.ppt

实验 七 蔗糖酶的制备和比活力的测定 1. 酵母蔗糖酶的制备； 2. 各级分蔗糖酶溶液活性的测定； （包括葡萄糖标准曲线的制备） 3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定； 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算。 蔗糖酶制备的原理 ? 酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内 侧，在细胞膜外细胞壁中的 , 称之为 外蔗糖酶， 其活力占蔗 糖酶活力的大部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。在细胞 膜内侧细胞质中的称之为 内蔗糖酶 ，含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨 基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸， Ser 和 Met ，它们的分子量也不同，外酶约为 27kDa( 或 22 kDa ， 与酵母的来源有关 ) ，内酶约为 13.5kDa 。 ? 两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似 ，因此，本实 验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，难提取， 本实验采用研磨水抽提， 提取纯化的主要是外酶 。 蔗糖酶制备的方法 ? 实验方法参看实验指导教材。 ? 注意级分 II 同书上有所不同 。在第二步进行热处理（ 50 ℃ ， 30 分钟）后，离心后将上清转移到烧杯中，此时取烧杯中 的上清约 1.5ml ，放在小离心管中，作为级分 II 。 ? 乙醇沉淀后的固体蔗糖酶，等量分装在两个 1.5ml 的离心管 中， 4 ℃ 下保存，做为下两次实验中的酶。 上清测 pH ，用 1M 乙酸调 pH 至 5.0 ，取出 1.5ml 用于测定酶活力和蛋白质含量 称取 10g 酵母和 5g 二氧化硅，放入研钵中 加预冷蒸馏水 30ml ，分多次加入，每次 5ml ，研磨 30min 分装入离心管中，平衡后离心 15min ， 4 ℃ ,10000rpm 上清再次同样条件离心 级分 I 上清转入离心管中， 50 ℃ 水浴 30min 平衡后离心 10min ， 4 ℃ ,10000rpm 上清转入小烧杯，取 1.5ml 用于测定酶活力和蛋白质含量 其余加入等体积预冷 95% 乙醇，搅拌均匀后放置 10min 级分 II 平衡后离心 10min ， 4 ℃ ,10000rpm 。 沉淀分装到两个 EP 管中 。 蔗糖酶活性测定原理 ? 蔗糖酶特异性催化非还原糖中的 α - 呋喃果糖苷键水解 , 具有 相对专一性 , 能催化蔗糖水解生成 D- 果糖和 D- 葡萄糖 , 也能水 解棉子糖生成密二糖和果糖 ? 3,5- 二硝基水杨酸与 还原糖 在 强碱性 溶液中 沸水浴 生成棕红 色氨基化合物 . 在 520nm 处有最大吸收 , 在一定范围内颜色深 浅与还原糖浓度成正比 ? 酶活性单位为 , 在一定条件下反应 5min, 每产生 1mg 葡萄糖所 需要的酶量。 实际应用是 1 ml 酶液所产生葡萄糖的量定为 1ml 酶液的活力。 ? 酶的比活力，每 mg 酶蛋白质所具有的酶活力。 葡萄糖标准曲线的制备 加毕混匀，盖上试管帽，于 沸水浴（ 100 ℃ ）中准确煮 5min ，取出 用自来水冷却 3min ， 加入 9ml 蒸馏水 ，混匀后以零号管调零，于 520nm 处测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐 标画葡萄糖标准曲线图。 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 1mg/ml 标准葡萄糖溶液 ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.1mol/L 醋酸缓冲液 pH5.0 ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 H2O ml 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 二硝基水杨酸溶液 ml 2 2 2 2 2 2 酶 活 测 定 取出后经自来水冷却 3min ， 加入 9ml 蒸馏水 ，以 标准曲线的“ 0” 管调 零点 ，于 520nm 处测光密度值。 以测定管的光密度值减去对照管光密 度值， 求得的差值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量，并 乘以 10 ， 即为每 1ml 酶溶液的活力。 （对照管中酶液最后加入） 1 （级分 I 和级分 II 测定管） 2 （对照 I 和对照 II ） 300mM 蔗糖溶液 ml 0.60 0.60 pH5.0 醋酸缓冲液 ml 0.2 0.2 H2O 1.1 1.1 25 ℃ 水浴中保温 3min 稀释 ? 倍 以后的酶液 ml （级分 I 和级分