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4 、双链 cDNA 的分级分离 连接前回收大于 500bp 的 cDNA 用于连接。去掉 引物、街头及反转录产生的各种不完整的 cDNA 链, 提高文库质量。 ? 5 、双链 cDNA 与载体连接 1 )同聚物加尾: 2 )加接头引入酶切位点, 添加带有限制性酶切位点的 接头是最常用的方法 3 ) cDNA 的定向插入: cDNA 两端添加不同的 限制性酶 切位点,双酶切后与对应的双酶切载体连接 同聚物加尾法: 末端转移酶 +dCTP 末端转移酶 +dGTP 载体和 cDNA 退火 加接头 CH3 CH3 CH3 接头 CH3 CH3 CH3 cDNA 的定向插入 ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切 载体 1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase NotI primer/adaptor SalI adaptor cDNA重组子 6 、 cDNA 文库的载体选择 一般 cDNA 的长度范围多在 0.5-8kb 之间, 因此不用考虑外源片段的长度。 质粒载体或噬菌体载体 7 、 cDNA 文库的均一化处理 均一化 cDNA 文库: 是指某一特定组织或细胞的 所有 表达基因 均包含其中,且在 cDNA 文库中表 达基因对应的 cDNA 的 拷贝数相等或接近 。 均一化 cDNA 文库是 克服 由于基因转录水平 上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措 施,有利于研究基因的表达和序列分析。 构建均一化 cDNA 文库主要有两种途径: 基因组 DNA 饱和杂交法 基于复性动力学原理的均一化学法 基因组 DNA 饱和杂交法 ? 理论基础:不同表达水平的基因对应的基因组拷 贝数相对一致。 步骤: 1 )基因组 DNA 的酶切、固定 2 )基因组 DNA 变性成单链 3 )分离纯化 cDNA 文库的混合质粒 4 )文库 DNA 与固定的基因组 DNA 充分饱和杂交,固 定相应的 cDNA, 5) 洗脱 cDNA 并重新转化受体菌。 ? 限制:由于基因组的复杂性,很难获得覆盖基因组的 单链 DNA 片段,导致文库内基因的丢失。 基于复性动力学原理的均一化方法 理论基础:复性动力学原理 cDNA 文库中高丰度 cDNA 复性所需时间较短,低丰度 cDNA 复性所需时间较长,通过控制复性时间可使高丰 度的 cDNA 复性成双链状态,而低丰度 cDNA 仍保持单 链状态,分离单链 cDNA ,转化宿主细胞,即可得到均 一化 cDNA 文库。 四、基因克隆的筛选策略 1 、表型筛选: 在宿主菌中表达目的基因,使宿主产生新的 表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的 基因。 (1) 抗药性筛选 : 这是利用载体 DNA 分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。 (2) 插入失活筛选法 (3) 显色反应选择法 (α - 互补法 ) 将含有 β - 半乳糖苷酶基因( LacZ )的调控序列和 氨基端( N 端) 146 个氨基酸编码序列的质粒转化 至可编码 β - 半乳糖苷酶羧基端( C 端)部分序列的 宿主细胞中,可使各自无活性的片段实现互补,融 为一体,产生具有酶学活性的蛋白,从而使转化的 宿主菌在含有 IPTG/X-gal( 异丙基 - β -D- 硫代半乳糖 苷 /5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 - β -D- 硫代半乳糖苷 ) 的培养基 上产生蓝色菌落,这种现象就称为 α - 互补。 第八章 DNA 文库的构建 教学目的 掌握:基因组文库构建的基本原理和步骤、 cDNA 文库构建的基本原理和操作技术; 熟悉: cDNA 第一链的合成、 cDNA 第二链的合 成; 一、基因文库 某一生物全部基因的集合 叫该生物的基因文库。 某一生物部分基因的集合叫 该生物的亚基因组文库。 基因文库( gene library) : 某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载 体在 体外重组 后, 转化宿主细胞 ,并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的 阳性菌落 (或噬菌体),所有 菌落或噬菌体的 集合 即为该生物的基因文库。 外源 DNA 片断、载体、宿主 构建基因文库的基本程序: ( 1 )提取研究对象基因组 D
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