红外光谱和拉曼光谱技术及其.ppt

(三) 导数光谱技术(微分光谱技术) FTIR光谱仪的导数光谱是利用计算机对光谱数据进行微分处理而得到的光谱，导数光谱在红外光谱中的应用主要是二阶导数谱。偶数阶导数可以容易分辨强峰上的小肩峰，在二阶导数谱中吸收峰方向与原谱相反，在四阶导数谱中吸收峰方向与原谱相同。 (四) 谱带拟合技术(曲线拟合技术、分峰拟合技术) 从数学角度来看，谱带拟合技术就是将一组重迭在一起的一个峰形较宽的吸收谱带通过适当的方法分解为一组单峰(子峰)。单峰(子峰)的数目和峰位置可以通过这个较宽的吸收谱带的二阶导数谱和去卷积谱得到。 图5-7. 傅里叶变换红外光谱数据处理技术(实线为水溶液，虚线为重水溶液) 左图：A. rhGM-CSF的差谱 右图：A. rhGM-CSF水溶液的曲线拟合谱 B. rhGM-CSF的二级微分谱 B. rhGM-CSF 50%重水溶液的曲线拟合谱 C. rhGM-CSF的去卷积谱 C. rhGM-CSF重水溶液的曲线拟合谱 注： rhGM-CSF—重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 第四节 傅里叶变换红外光谱的基本技术 一、近红外光谱(NIR)技术 近红外谱区的波长范围为0.75-2.5μm, 波数范围为13330cm-1 － 4000cm-1。分子在近红外区的吸收主要由一些能量较低的电子跃迁, 以及分子振动状态间跃迁所产生。在NIR区，分子的振动信息与中红外区的分子振动基频吸收不同，NIR区由于频率较高，分子对其吸收主要是分子振动的倍频吸收与合频吸收。 应用领域: 水含量分析: 织物、纸张含水量的测定； 蛋白质、脂肪、氨基酸、淀粉含量的分析；药物分析。 第五节 傅里叶变换红外光谱在生物医学研究中的应用 构成细胞的生物大分子有四类，即蛋白质、核酸、酯类和碳水化合物。应用红外光谱研究处于水溶液自然环境下的生物分子必须克服两个障碍: 水或重水的强红外吸收，以及生物样品在我们感兴趣的光谱区域具有较宽的吸收峰。常用的方法有选用氟化钙或氟化钡作为红外窗片，做成5um左右的液体池；当红外测定所用的蛋白质浓度较高时, 才能得到具有较好信噪比的谱图。 对于重迭部分的红外光谱图一般使用二阶导数谱 （Second Derivative Spectra）、傅里叶自去卷积(Fourier Self-Deconvolution)以及曲线拟合（Curve Fit）, 得到分辨率增强的红外光谱图, 再进行定性和定量分析。 一、蛋白质的二级结构研究 蛋白质和多肽的结构测定一般依赖于X-射线晶体学技术、NMR、CD、红外光谱和拉曼光谱方法, FTIR可以有效测定蛋白质溶液的二级结构。 (一) 蛋白质二级结构测定 蛋白质是由氨基酸以酰胺键共价连接而成的多肽链构成的，同一多肽链或不同多肽链之间还以二硫键形成侧链共价交联。蛋白质的二级结构是指蛋白质中多肽的规则排布，由主链极性基团的氢键形成。 常见的二级结构有a-螺旋、β-折叠、 β-转角和无规卷曲等。这些结构或其它构象都有其特定的氢键结构，而这些氢键结构的差异可以通过红外光谱得到反映，主要表现为谱带峰位及半高宽的变化。这就使我们有可能利用峰位不同的谱带来识别不同的二级结构及其组成情况。 表5-4 肽链的红外特征吸收谱带 吸收带名称 酰胺A 酰胺B 酰胺Ⅰ 酰胺Ⅱ 酰胺Ⅲ 酰胺Ⅳ 酰胺Ⅴ 酰胺Ⅵ 酰胺Ⅶ 频率(cm-1) ~3300 ~3100 1690-1600 1575-1480 1301-1229 767-625 800-640 606-537 ~200 振动模式说明 NH伸缩振动与酰胺Ⅱ第一倍频 共振吸收 C=O伸缩 CN伸缩，NH弯曲 CN伸缩，NH弯曲 OCN弯曲，混有其它振动模式 NH面外弯曲 C=O面外弯曲 骨架扭动 一般蛋白质和多肽的傅里叶变换红外酰胺Ⅰ谱带去卷积谱包含9～11个子峰，各子峰的精确峰位由二阶导数谱确定，各子峰的结构归属通过已知结构的蛋白质的研究予以确定。 操作步骤： 1)测定1600~1700cm-1范围的酰胺Ⅰ谱带； 2)作差谱扣除介质的红外吸收； 3)作傅里叶去卷积变换和二阶导数数值处理，求出去