5酶学与酶工程酶分子修饰学生.ppt

College of Life Sciences ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应 (PCR) 产生定点突变 College of Life Sciences ? ① Kunkel 突变法 ? 当 E.coli 发生 dUTP 酶缺陷突变时 (dut - ) ，由于这类细胞不能 把 dUTP 转化为 dUMP ， 所以细胞内的 dUTP 量大为增加， 其中一些 dUTP 可以搀入 DNA 正常情况下由胸腺嘧啶占据 的位置。 ? 正常情况下， E.coli 可以合成一种尿嘧啶 -N- 糖基化酶 （ ung ），它可以去除搀入到 DNA 中的尿嘧啶。 ? 然而，当 E.coli 为 ung - 时，该酶失活，故尿嘧啶不能从 DNA 链中剔除，使细菌 DNA 中尿嘧啶含量增加。 ? 在 dut - ung - F ' 菌株中，这个比例有所提高。从而使得生长 于这一菌株的 M13 噬菌体的 DNA 中将含有 20-30 个尿嘧啶。 College of Life Sciences ? 先把想要诱变的质粒放到一个 ung- 突变型的 E.coli 里，做出 一个 T 全部被 U 代替的单链 DNA 的“模子”，然后把这个 模子和核苷酸一起放到适宜条件下培养（ ATP 、聚合酶 等）。 ? 放进去的核苷酸除了想要诱变的位点以外，其它全和模子 是碱基互补配对的，在 DNA 连接酶的作用下就会产生一 个杂交的双链 DNA ，一条是模子，一条是定点诱变的产 物。再把这个双链 DNA 放到 ung+ 细菌体内让它把模子酶 解掉，再以诱变产物为模板生产质粒，就得到了很多很多 诱变过的质粒。。。 College of Life Sciences College of Life Sciences ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ? pALTER-1 质粒的特征： ? 多克隆位点； ? 含有四环素抗性（ Tet r ）和氨苄敏感性（ Amp s ） ? 利用辅助噬菌体超感染 , 制备含目标基因的单链 DNA 作为突变模板 DNA 。 College of Life Sciences College of Life Sciences ? 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而 改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修 饰。 ? 包括物理修饰、化学修饰，分子改造等 College of Life Sciences ? 一、酶修饰的作用 ? 1. 稳定酶的天然构象与增强耐热性 ? 2 ．保护酶活性部位与抗抑制剂 ? 3 ． 维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 ? 4 ． 降低酶的抗原性及稳定酶的微环境 ? 5 ． 改变酶学性质 College of Life Sciences ? 二、酶修饰的方法 ? 化学修饰 ? 酶改造的分子生物途径 ? 酶分子的物理修饰 College of Life Sciences ? 一、酶分子化学修饰的一般问题 ? 酶分子的化学修饰对酶结构与功能、酶的催化机制 等酶学研究方面有着重要作用，而在酶工程中所运 用的修饰方法与基础研究的要求有所不同。 ? 1 ．选择酶分子修饰剂 ? 理想的修饰剂是选择性高、在温和反应条件下能进 行修饰反应、被修饰的功能基在温和条件下能再生。 College of Life Sciences ? ① 能选择性地与一个氨基酸残基反应； ? ② 反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行； ? ③ 被标记的残基在酶中稳定，容易通过降解分离出 来并鉴定； ? ④ 反应程度能用简单的技术测定。 College of Life Sciences ? 选择修饰剂时要考虑几点： ? ① 修饰剂的相对分子质量、修饰剂链的长度对蛋白 质的吸附性； ? ② 修饰剂上反应基团的数目及位置； ? ③ 修饰剂上反应基团的活化方法与条件。 College of Life Sciences ? 2 ．选择反应条件 ? ① 反应体系中酶与修饰剂的分子比例； ? ② 反应体系的溶剂性质、盐浓度和 pH 条件； ? ③ 反应温度及时间。 ? 3 ．修饰剂的活化 ? 活化基团才能在一定条件下与酶分子的某侧链基团 进行反应 College of Life Sciences ? 4 ．修饰 ? 将带有活化