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实验二 蛋白酶抑制剂的明胶 - 聚丙烯酰 胺凝胶电泳 一 . 目的： 1. 学习和掌握 蛋白酶抑制剂电泳 基本原理及电 泳技术。 2. 熟练掌握蛋白酶抑制剂电泳有关试剂配制的 技术和制胶技术。 二、原理： ( 一 ). 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ? 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为 PAGE （ Polyacrylamide gel electrophoresis ） : ? 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。 ? 单体的丙烯酰胺（ CH2=CHCONH2 Acrylamide ，简称 Acr ） ? 甲叉双丙烯酰胺（ CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N - methylenebisacrylamide, 简称 Bis ） ? 聚合而成，这一聚合过程需要有 自由基催化 完成。 ? 常用的催化聚合方法有两种： ? 化学聚合和光聚合。 ? 化学聚合 : 加入 催化剂过硫酸铵 ［（ NH4 ） 2S2O3] （即 AP ）以及 加速剂四甲基乙二胺 （ TEMED ），四甲基乙二 胺催化过硫酸铵产生自由基，这样由于乙烯基“ CH2=CH －”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链，同时 甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键 交联，从而形成 交联的三维网状结构 。 ? 氧气对自由基有清除作用 ，所以通常凝胶溶液聚合前要 进行抽气。 ? 光聚合 : 催化剂是核黄素 ，核黄素在光照下能够产生自 由基，催化聚合反应。一般光照 2 － 3 小时即可完成聚合 反应。 ? 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单位构成的长链，链 与链之间通过甲叉桥联结在一起。 ? 链间纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶 具有分子筛 性能 。 ? 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具 有良好的抗对流作用。 ? 长链上富含酰胺基团，使聚丙烯酰胺成为稳定的亲水凝 胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。 ? 这些特点使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介 质。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由 凝胶浓度（ T ％） 和 交 联度（ C ％） 决定。 每 100mL 凝胶溶液中含有的单体 (Acr,a) 和交联剂 (Bis,b) 总克数称为凝胶浓度，用 T ％ 表示。 凝胶溶液中，交联剂 (Bis) 占单体 (Acr) 和交联剂 (Bis) 总量的百分数称为交联度，用 C % 表示。 ? 改变凝胶浓度（ T ％）和交联度（ C ％）， 可获 得不同密度、粘度、弹性、机械强度和 孔径大小的 凝胶 ，以适应各种样品的分离。 ? 一般常用 7.5% 浓度 的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质， ? 用 2.4% 的分离核酸 。但根据蛋白质与核酸相对分 子质量的不同，适 用的浓度也不同。 富有弹性，且完全透明的凝胶， a 与 b 的重量比应在 30 左右。选择 T 和 C 的经验公式是： C = 6.5 － 0.3T 此式可用于计算 T 为 5 ％～ 20 ％时的凝胶组成。 C 值并 不很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为 ? 1 ％， 当 C 保持恒定时，凝胶的有效孔径随着 T 的增加而减小，当 T 保持恒定， C 为 4 ％时，有效孔径最小， C 大于或小于 4 ％ 时，有效孔径均变大， C 大于 5 ％时凝胶变脆，不宜使用， 实验中最常用的 C 是 2.6 ％和 3 ％。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉 双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在 3 ％～ 30 ％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如 3 ％的聚丙 烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等 电聚焦或 SDS － PAGE 电泳的浓缩胶，也可以用于分离 DNA ； 高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用， 可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如 10 ％～ 20 ％的凝胶常用于 SDS － PAGE 电泳的分离胶。 配称 30 ％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存 1 个月，在 贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗 现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是 一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触 皮肤，但它们聚合后则无毒。 由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因而四十年来得 到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其 主要的优点有：①可以随意控制胶浓度“ T ” 和交联度“ C ” ， 从而得到不同