牛蒡子木脂素成分的抗肿瘤作用和机理研究.docxVIP

牛蒡子木脂素成分的抗肿瘤作用和机理研究 癌症是全世界范围内的一个主要的健康问题。 因为有些肿瘤患者死于对现有 的抗癌药物不敏感 , 或者在经过一定时间的治疗 , 对已有药物产生耐药性 , 所以在 目前 , 研究和开发新的抗癌疗法和抗癌药物是有价值和迫切需要的。 本论文的研究目的是在天然产物中发现抗癌的先导化合物并研究其体内和 体外的作用效果和机理。 背景与目的根据现有文献和我们以前的实验结果数据显 , 在中药牛蒡子中 , 两个木脂素类化合物牛蒡子苷元和牛蒡子苷发现对一系列肿瘤细胞具有抗肿瘤作用。 牛蒡子苷元 , 牛蒡的种子中发现的一种活性化合物 , 可以根除缺乏营养的肿瘤细胞。在除了它对不同肿瘤细胞株的广谱抗肿瘤活性结果 , 例如胰腺癌细胞系 PANC-1和 AsPC-1,牛蒡子苷元对于在葡萄糖剥夺条件下的癌细胞表现出一个高 选择性细胞毒作用 [91] 。 牛蒡子中的拉帕酚 B, 拉帕酚 A 和异拉帕酚 A 对于白血病 K562细胞的 IC50 分别为 38.5 μg/ml,53.5 μ g/ml,51.1 μg/ml[137] 。因此 , 研究牛蒡子中木脂素 类化合物的抗肿瘤活性及作用机理 , 从而发现安全有效地抗肿瘤先导化合物仍具 有十分重要的意义。 方法 (1) 牛蒡子提取物氯仿部位经由正相硅胶 ,SephadexLH-20 凝胶色 ,ODS-B反相硅胶色谱分离出牛蒡子苷 , 牛蒡子苷元和 LappaolF 。用波谱解析的方法 , 对其结构进行了鉴定。 对所有分离的化合物的光谱数据进行了测定 ; 在 TU-1901 紫外光谱仪 ( 普析通用 , 中国 ) 上测定紫外吸收光谱 ; 在 API 2000 的 LC/MS/MS测量设备测定电喷雾电离 - 质谱 (ESI-MS); 在 Bruker drx-400 记录 1H和 13C核磁共振谱 (NMR),以四甲 基硅烷 (TMS)仪器使用作为内标。 (2) 牛蒡子苷元 , 牛蒡子苷 , 和 LappaolF, 采用 MTT法和平皿克隆法对肿瘤细胞株进行药效学检测。 通过流式细胞仪测定细胞周期。蛋白质印迹法法分析研究化合物作用机理。 在 HeLa肿瘤细胞荷瘤裸鼠体内对 Lappaol F, 牛蒡子苷和牛蒡子苷元进行药效学试验。结果 1. 牛蒡子中木脂素类化合物的制备。 通过各种色谱方法分离得到牛蒡子中的三个化合物 ,1-3 。通过光谱解析 , 结 合化合物的薄层层析结果和紫外光谱数据 , 与文献 1H和 13C NMR数据比较 , 化合 物 1-3 分别被确定为牛蒡子苷元 ,LappaolF 和牛蒡子苷。 通过戴安 P680 型高效液相色谱仪进行纯度测定。 测定条件 :PDA-100 二极管 矩阵检测器设定吸收波长为 280 nm。 色谱柱为菲罗门 Luna, 柱长 4.6 x 150mm, 柱填料孔径 5μm,柱温 35℃, 甲醇 和水为流动相 , 比例为 47%的甲醇和 53%水( 体积 / 体积 ), 流速 1.0mL/min 。 LappaolF 的出峰时间在 15.93 分钟。 牛蒡子木脂素的体外抗肿瘤药效学研究 LappaolF 呈时间和剂量依赖性抑制肿瘤细胞增殖 , 对 MCF-7,MDA-MB-231和 RKO细胞的半数抑制浓度 (IC50) 分别为 13.3,16.8 和 25.2 μM。同时 ,LappaolF 对人正常乳腺 MCF-10A细胞 ,3 天或治疗 时间延长到 6 天处理时表现出极小的细胞毒性。 3.Lappaol F 的抗肿瘤作用机制 . 流式细胞仪分析结果表明 ,Lappaol F 显著 增加了 2N G1 期细胞比例或 4N G2/M期细胞比例。在 MCF-7和 HeLa细胞中 , 细 胞主要被主要阻滞在 2N G1 期。 实验结果显示 ,LappaolF 处理的 MCF-7细胞中在 G1期观察到的数量显著的 增加 ( 从 65%到 87%);Lappaol F 处理的 HeLa细胞中在 G1期观察到的数量显著的 增加 ( 从 56%至 67%)。同时 ,LappaolF 处理的 HeLa细胞中在 G1前期观察到的数 量也显著的增加 ( 从 1%至 15%)。 MDA-MB-231和 RKO细胞中 , 细胞主要被主要阻滞在 4N G2/M期。实验结果显示 ,LappaolF 处理的 MDA-MB-231细胞中在 G2期观察到的数量显著的增加 ( 从 21%到 45%);Lappaol F 处理的 RKO细胞中在 G2期观察到的数量显著的增加 ( 从 19%到 71%)。 研究结果表明 ,LappaolF 的分子机制是通过调节细胞周期依赖蛋白阻滞剂 的表达水平来诱导细胞周期阻滞。实验显示 ,Lappaol F 处理