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分子标记辅助选择育种 分子标记辅助选择育种 分子标记辅助选择育种 传统的育种主要依赖于植株的表现型选择 (Phenotypieal selection) o环境条件、基因间互作、基因型与环境 互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条 件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、 鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7?8年甚至十几年 时间。如何提高选择效率，就是育种工作的关键。 育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选 择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标 记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的 紫色叶鞘等形态性状标记,在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍 体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记， 在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴 定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要就 是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型 差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但就是它们多态 性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足 遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗 传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分 析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其就是分子标记 辅助选择(molecular marker-as—sisted selection, MAS)育种更受到 人们的重视。 第一节分子标记的类型与作用原理 一、分子标记的类型与特点 按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类就是以分子杂交 为基础的DNA标记技术,主要有限制性片段长度多态性标记 (Restriction fragment length polymorphisms, RFLP 标记)；第二类就 是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR反应)为基础 的各种DNA指纹技术。PCR就是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引 物与4种脱氧核糖核昔酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的体外酶促 反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模 板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性 (annealling) ＞延伸(exten一sion)三步(图17—1) o变性指的就是通过 加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程;复性(又 称退火)就是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板 分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板 DNA,容易使引物与其互补的模板在局部形成杂交链;延伸就是指在DNA 聚合酶与4种脱氧核糖核昔三磷酸底物及MQ存在的条件下，在聚合酶 催化下进行以引物为起始点的5?-3*的DNA链延伸。以上三步为一个循 环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25?30个循环后，介 于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2X106-7拷 贝。按照PCR所需引物类型又可分为:①单引物PCR标记,其多态性来源 于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态 性 DNA 标记(Random 别 amplification polymorphism DNA, RAPD)、简单 重复序列中间区域标记(inter-simple sequence repeats polymorphisms, ISSR)等技术;②双引物选择性扩增的PCR标 记,主要通过引物3端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指扩增片 段长度多态性标记(Amplified fragment lengthpolymorphisms, AFLP); ③需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标 记(Simple sequence repeats, SSR) 序列特征化扩增区域(Segion,简 称SCAR技术)与序标位(Sequence一tagged sites,简称STS)等。第三类 就是一些新型的分子标记，如单核昔酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP),由基因组核昔酸水平上的变异引起的DMA序列多态 性,包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入/缺失等。表达序列标 签(Expressed sequences tags, EST)就是在eDMA文库中随机挑选克隆， 并进行单边测序(Singlepass sequence)而产生的300?500bp的核昔 酸片段。 应用于分子标记辅助育种