第六章-基因在原核及真核体系中的表达.pptVIP

2021/2/6 * 2、SV40病毒载体的发展 （1）取代型载体 需辅助病毒（含被取代的病毒基因部分） （2）重组的病毒-质粒载体 含完整早期区段和复制起点 穿梭载体 四、反转录病毒载体 优点:可正常转录、寄主广、感染效率高 2021/2/6 * 主要类型: 辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体 假病毒（辅助病毒） 不需辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体 病毒结构组分整合于基因组 2021/2/6 * 五、其他的病毒载体 1、痘苗病毒载体(Vaccinia) 广泛寄主、天花疫苗 2、乳头瘤病毒载体(Papilloma) 与人类关系密切 3、腺病毒载体（Adenoviruses） 可插入较大DNA 2021/2/6 * 复习提纲 5、胸腺激酶基因选择系统的工作原理。 6、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法及其原理和特点。 7、什么是电穿孔法?什么是脂质载体法?有怎样的特点? 8、常用的病毒载体有哪些? 2021/2/6 * 第六章 基因在原核及真核体系中的表达 第一节 真核基因在大肠杆菌中的表达 DNA? Protein 一、真核基因在大肠杆菌中的表达 1、理论上的困难: 遗传机制的差异 基因结构、 mRNA结构、转录信号（SD）、细菌蛋白酶、蛋白的后加工 cDNA、使用原核启动子及SD序列、引入突变体 2021/2/6 * 2、克隆基因表达的基本条件 启动子、SD、正确插入方向 3、增强外源蛋白稳定性的途径 1977-化学合成脑激素的表达 形成融合蛋白（? -内啡肽-? -半乳糖苷酶）以胰蛋白酶切割-适合链内不含Met的蛋白 低蛋白酶活性突变体 T4 phage的pin基因 2021/2/6 * 二、原核生物的表达载体 1、Lac 启动子的表达载体 阻遏作用区、CAP作用区、RNA聚合酶作用区 2、Trp启动子的表达载体 trp启动子、操纵基因、前导序列 3、PL启动子的表达载体 CI的温敏突变（CI857)-阻遏蛋白在42? C 失活 三、高等真核基因在大肠杆菌中表达的实例 2021/2/6 * 1、胰岛素基因在大肠杆菌中的表达 化学合成A、B链,分别融合? -半乳糖苷酶,得到? -gal-A和? -gal-B,活性低 胰岛素原基因的克隆及表达,体外切割祛除C肽 2、生长激素 四、提高克隆基因表达效率的途径 1、启动子的结构对表达效率的影响 -35 TTGACA -10 TATAAT 合成启动子tacI(11 Lac) tacII(8Lac) -35与-10间17bp最高活性 2021/2/6 * 2021/2/6 * 2021/2/6 * 启动子最佳距离的探测 目的基因 E E 启动子 A 酶切开 Bal31酶解 A E E 目的基因 2021/2/6 * 2、转译起始序列对表达效率的影响 转译起始的保守序列: AUG、SD(UAAGGAGGU的部分或全部）、核糖体的结合位点有一个或几个终止密码子、含全部或部分PuPuUUUPuPu 其他: SD后的4碱基4 A或4T（GC则25%-50%）、起始密码子左边UAU、CUU最好,UUC UCA AGG 下降20倍 3、启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响 2021/2/6 * 4、质粒拷贝数对表达效率的影响 5、转录终止区对克隆基因表达效率的影响 终止区存在的必要性: 转录产物越长,RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加,外源基因本身的转录效率下降; 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域,如选择性标记基因和复制子结构等,则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能,甚至导致重组质粒的不稳定性; 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗; 更为严重的是,过长的转录物往往不能形成理想的二级结构,从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率 2021/2/6 * 终止子 强终止的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子,通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构,以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样,通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选 pCP1 Apr ori Tcr 筛选Apr、Tcs的转化子 2021/2/6 * 6 、质粒分离的不稳定性对效率的影响 质粒分配由par控制 克隆该基因 保持选择压力 反选择:质粒含CI, 宿主是溶源化细菌,其噬菌体启动子缺陷 7、密码子的使用频率(bias) 2021/2/6 * 2021/2/6 * 2021/2/6 * 2021/2/6 * 复习提纲 1、真核基因在大