生物化学实验：维生素C的提取及含量测定b.ppt

维生素C的提取及含量测定 一、实验目的 学习维生素C的重要性质 掌握2,6-二氯酚靛酚法测定维生素C的原理和方法 二、实验原理 维生素C的结构与性质 维生素定量测定 维生素C与坏血病 结构与性质 维生素C/ L-抗坏血酸(ascorbic acid) 多羟基，内酯；酸性； 易被氧化：中、碱性，热，光，重金属破坏 维生素C的功能 维生素C是重要的供氢体 促进胶原合成—坏血病 来源 新鲜水果及 蔬菜: 橙类 、番 茄 、辣椒 富含维生素C量高的食物（毫克/100克食物) 酸 枣——830-1170猕猴桃——568枣 ——549辣 椒——185山 楂——89柿子椒——89菜 花——88金花菜——85苦 瓜——84雪里红——83 2,6-二氯酚靛酚 ——氧化还原指示剂 三、实验内容 样品处理： 2.0g猕猴桃 5～10ml 1%的草酸研磨成浆状 50ml的容量瓶定容 过滤 三组滴定？ 2,6-D的标定 ： 5ml 1%草酸+5ml 0.001mol／L维生素C (176.13) 2,6-D滴定到浅红色，30s ；3次 （10x2,6-D) 计算1ml 2,6-D相当于维生素C的mg数——T 样品滴定： 50ml 锥形瓶：滤液5ml（移液管） 2,6-D滴定到浅红色，30s ；3次 空白滴定： 50ml 锥形瓶：5ml l％草酸 2,6-D滴定到浅红色，30s ；3次 计算结果 100g 样品含维生素C的mg数=Bx(A-E)xTx100/CxD A——滴定样品所消耗的2,6-二氯酚靛酚钠的平均 毫升数； E——滴定空白所消耗的2,6-二氯酚靛酚钠的平均毫升数； B——样品提取液的总体积（50ml）； C——每次滴定所用的提取液的毫升数（5ml）； D——提取所用的样品重量（2g）； T ——1ml 2,6-D相当于维生素C的mg数。 四、操作要点 定容 过滤 滴定 移液管使用 手/电动移液器 滴定管的使用 思考题 为什么维生素C标准溶液要用新鲜配制的？ 为准确测得维生素C的含量，实验时要注意那些操作步骤？ 多酚氧化酶的制备和性质研究 一、实验目的 了解植物组织褐变和多酚氧化酶的关系。 学习多酚氧化酶的提取和活力测定方法 了解影响酶促反应速度的各种因素 果蔬褐变 多酚氧化酶催化的反应 二、实验原理 酶的分离纯化： 材料的选择（新鲜、目的蛋白含量高） 分离过程中避免一切可能引起变性的条件 蛋白质的纯化一般在低温下进行（4oC） 细胞破碎：机械破碎 分离目的蛋白：盐析法 机械破碎——组织匀浆机 三、实验内容 多酚氧化酶的制备： 50g小块土豆 + 50ml氟化钠（600g/班） 捣碎机中研磨30s 3-5层纱布过滤（20ml滤液/组） 等体积饱和硫酸铵，4℃，30min 离心4℃，6000r/min，10min 沉淀 + 15ml柠檬酸缓冲液 离心4℃，6000r/min，10min 上清→多酚氧化酶粗制品 多酚氧化酶的性质 多酚氧化酶的作用 ：催化的反应 多酚氧化酶的化学性质：稳定性 底物专一性（邻苯二酚，对苯二酚，间苯二酚 ） 底物浓度 酶浓度 氢离子浓度 （移液管） 四、操作要点 公用试剂的使用、玻璃器皿清洁、定量、定时 离心机及其使用 离心机是利用离心力对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种专用仪器。 非冷冻离心机：转速小于4000rpm；台式高速离心机最大转速可达18000rpm。 低速冷冻离心机 ：转速一般不超过4000rpm 高速冷冻离心机 ：转速可达20000rpm，收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸沉淀物以及免疫沉淀物等。 超速离心机 ：转速可达50000rpm，能使亚细胞器分级分离，并用于蛋白质、核酸分子量的测定等。 转 头 离心管 开启离心机控制电闸 打开离心机电源开关 选择转头 将转头放入离心机内预冷 平衡离心管 离心管放入转头 拧紧转头盖 关闭离心机盖 设定离心转头速度、温度、时间，开始离心 离心结束后 取出离心样品管 取出转头，擦干、清洁转头 关闭离心机电源开关 关闭离心机控制电闸 五、思考题 为什么滤液为红色时应重新取材提取多酚氧化酶？ 怎样可以使切好的土豆丝不变色？ 怎样配制1000ml柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH4.8） 50 Ti Rotor JA 20.1 Rotor JA-18 Rotor JA17 Rotor （a）水平转头；（b）固定转角转头；（c）垂直离心管转头 * L-抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 *若脱氢维生素C进一步氧化，则失去活