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第八章 高效液相色谱法;8.1 概述 ;8.1 概述;;8.1 概述;8.1 概述;8.1 概述;8.1 概述;8.1 概述;8.1 概述;8.1 概述;8.1 概述;8.2.1 示例 ;8.2.1 示例;8.2.1 示例;8.2.1 示例;8.2.2 结构;色谱柱;8.2.3 主要部件;;8.2.3 主要部件;在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，使流动相的强度、极性、pH或离子强度发生变化，从而改变被测组分的相对保留值，提高分离效率。 作用类似于气相色谱中的程序升温。;外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。;内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。;3. 进样系统;8.2.3 主要部件;8.2.3 主要部件;8.2.3 主要部件;8.2.3 主要部件;8.2.3 主要部件;8.2.3 主要部件;8.2.3 主要部件;光源;8.2.3 主要部件;8.3 主要分离类型和原理;8.3.1 液－固吸附色谱;（1）. 类 型;8.3.1 液－固吸附色谱; 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。 (相对溶解度的差异) 流动相： 亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性(正相 normal phase)，反之流动相的极性大于固定液的极性(反相 reverse phase)。 正相与反相的出峰顺序相反。;正、反相色谱中极性和保留时间的关系;（1）. 全多孔型担体; （2）. 表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量低。;（3）. 化学键合固定相;? 传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；; 分离机制（由键合基团的覆盖率决定）;8.3.3 离子交换色谱;8.3.3 离子交换色谱;8.3.3 离子交换色谱; 由离子交换色谱法派生出来。 与离子交换色谱的区别： ;8.3.4 离子色谱法;8.3.5 离子对色谱;8.3.5 离子对色谱;8.3.5 尺寸排阻色谱;8.3.5 尺寸排阻色谱;2. 半硬质凝胶;8.3.6 亲和色谱;8.3.6 亲和色谱;类 型 主要分离机理 主要分析对象或应用领域 吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备 分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备 尺寸排阻色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定 离子交换色谱 库仑力 无机离子、有机离子分析 离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析 离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析 疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化 手性色谱 立体效应 手性异构体分离，药物纯化 亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析;8.4 高效液相色谱流动相;8.4 高效液相色谱流动相;8.4 高效液相色谱流动相;8.4 高效液相色谱流动相;8.4 高效液相色谱流动相;8.4 高效液相色谱流动相;8.5 影响分离的因素;? 液体的粘度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。;8.5 影响分离的因素;8.5 影响分离的因素;8.6 分离类型的选择;2. 根据溶解度选择;2. 根据溶解度选择;8.6 分离类型的选择;8.6 分离类型的选择; 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 分析色谱柱：内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 半制备柱：内径8 mm，长度15 ～ 30 cm，一次制备量0.1～１mg。;1.色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。;2. 液相制备色谱的方法;3. 制备型液相色谱