Ras协同mTORSREBP1―c上调miR―182―96―183在肝癌中表达.docxVIP

Ras协同 mTORSREBP1―c 上调 miR― 182― 96― 183 在肝癌中 表达 【摘要】目的：探讨 Ras癌基因诱导的 miR-182-96-183 高表达机制。方法： 采取 H-ras12V 转基因小鼠肝癌及癌旁组织， miRNA 高通量测序检测 miR-182-96-183 基因表达水平。 Wes ternblot 检测调控 miR-182-96-183 表达的相关信号通路 活化状态及其上游转录因子蛋白表达水平。结果： miRNA 高 通量测序结果表明：与 PT 相比， T 中 m1R-182-96-183mRNA 表达显著升高（ P0.01）。 Wes ternblot 检测结果表明：与 PT 相比， T 中 ERK、mTOR活化水平显著升高， SREBP-lc蛋白水平显著升高。结论： Ras癌基因可能通过活化 mTOR通路激 活 SREBP-1c上调 miR-182-96-183 的表达水平。 【关键词】 肝癌； miR-182-96-183 ：Ras：mTOR：SREBP-1c Ras信号通路激活在肝癌中普遍存在 [1] 。miRNAs 可通过 抑制其靶基因的翻译在癌症的发展过程中扮演重要角色 [2] ， 同时有研究表明 miR-182-96-183 家族在多种原发性肿瘤中发 挥关键作用 [3] 。我们前期进行的 miRNA 高通量测序发现 miR-182-96-183 在肝癌组织中显著表达，但其在 Ras诱导的 肝癌中高表达机制尚不清楚。 本研究利用 H-ras12V 转基因肝 癌小鼠模型 [4] 初步探讨了 miR-182-96-183 在肝癌中的表达调 控机制。 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 SPF级 H-ras 12V 转基因小鼠，雄性， 9 月龄，体重 30～40g，大连医科大学 SPF实验动物中心。 生产许可证 SCXK（辽） 2016-0003，使用许可证 SYXK（辽） 2016-0006。 1.1.2 试剂 抗体 p-ERK、 p-mTOR、 SREBP-1c购自 Cell Signal公司。 1.1.3 仪器 BG-blotMINI 垂直转印仪等。 1.2 方法 1.2.1 组织样本的采集 分别采取转基因小鼠肝癌和癌旁组织，迅速液氮冷冻保 存。 1.2.2 miRNA 高通量测序 组织样本送至晶能生物公司进行 Illumina miRNA 测序。 具体方法参见文献。 1.2.3 Westemblot 检测 45μg 蛋白 10%SDS分离并转膜，封闭，一抗孵育 过夜。二抗孵育 1h，显影，实验重复三次。 1.3 统计学方法 采用 SPSS 17.0统计分析。计量资料以 x 土 s 表示， Shapiro-Wilk 法检验数据符合正态分布，根据 Levene 方差齐 性检验，两组间差异比较采用 t 检验。检验水准 α=0.05。 2 结果 2.1 基因芯片检测转基因小鼠肝组织 miR-182-96-183 表 达水平 高通量 miRNA 表达测序分析如表 1，H-ras12V 转基因小鼠肝癌旁组织 miR-96、 miR-183 表达值为 0，在肝癌组织中表达量显著增高（ P0.01）， miR-182 在肝癌 ?M 织中表达量 显著高于癌旁组织（ P0.01）。 2.2 ERK、 mTOR、 SREBP-1c表达水平检测 如图 1 所示，与癌旁组织相比，肝癌组织中 p-ERK、 p-mTOR、SREBP-1c蛋白表达显著升高。 讨论 miRNA 是一类长度约为 22nt 的非编码单链小分子 RNA， 参与转录后基因表达调控 [6] 。有研究表明，肿瘤的发生伴随 miRNAs 特异性表达 [2] 。为了探究 Ras癌基因诱导肝癌发生 过程中 miRNAs 的表达变化，采用高通量测序对 H-ras12V 转 基因小鼠肝组织 miRNAs 表达水平进行检测。结果发现，与 癌旁组织相比， 肝癌组织中 miR-182-96-183 显著升高（表 1）。 miR-182-96-183 是由同一染色体转录经初体、前体剪切 修饰生成的 3 个成熟体 miRNA[3] ，可抑制下游靶基因的翻译 发挥关键作用。大量研究表明， miR-182-96-183 的高表达在 肝硬化、肝癌中发挥关键作用 [6] ，有研究发现， PI3K/AKT/mTOR可诱导转录因子 SREBP可直接调控 miR-182-96-183 的转录 [7] 。实验结果表明，在肝癌中 mTOR 活化水平显著增高， 转录因子 SREBP-1c表达显著增高（图 2）。由此推测： Ras诱导的肝癌发生中可能通过 PI3K/AKT/mTOR 诱导 SREBP-1c促进 miR-182-96-183 的表达。 综上所述，