杂交瘤细胞克隆化培养及其分泌的单克隆抗体的纯化.docVIP

O O 杂交瘤细胞克隆化培养及其分泌的单克隆抗体的纯化 汪永和魏祥志何明坤 】R73.3 【 】A 【 】1671-8054（2008）05-0081 -02 】目的：纯化单克隆抗体。方法：先将分泌单抗N35的杂交瘤细胞P35作克隆化培养，再应用心前A?sepha「ose CL4B 制备免疫亲和层析柱，纯化单克隆抗体。结果：单抗纯化后电泳呈一条带，且保存良好的免疫活性。结论：有限稀释法对 细胞进行克隆化培养是十分有效的，应用protein A-sepharose CL-4B亲和层析法可以有效地纯化单克隆抗体 O 】有限稀释纯化亲和层析单克隆抗体N35 A图示第1泳道是杂交*伽絶克达別86.1%（未丸隆化之罚的纯/t 仅为50%）故可能还擴再进行 A图示第1泳道是杂交*伽絶克 达別86.1%（未丸隆化之罚的纯/t 仅为50%）故可能还擴再进行2-3 次的丸隆化培养可能才能达刘 95%以上的比度。第2泳it是 Marker（从上到下的分子童分别是 116x97.67.43 x10? ） 123456789 10 B图示1-10泳it分 别加的*:1.正常人 淋巳细胞t2.YTLC 性华.与正常人纽饮 和淋已细也无反 与人胚林及君官俎 肺癌病死率很高，患者前来就诊时大多已属 中、晚期，无法手术和其他治疗，只有早期发现才有 可能提高5年生存率。本课题是纯化单抗N?35,它 与各型肺癌有较高的反应阳性率，与正常人组织和 淋巴细胞无反应，与人胚肺及各器官组织基本无反 应⑴。由此可以进一步纯化N35相关蛋白，从而使肺 癌可望得到早期诊断 1.1实验材料细胞株：云南个旧肺腺癌GLC-82 细胞及杂交瘤P35细胞，由昆明医学院第一附属医 院肿瘤研究所建立。主要试剂：protein A -sepharose CL-4B购于Am ershanic主要仪器、设备：凝胶图象 分析系统BI0-RAD微型胶垂直电泳仪、AKTA纯化 系统均购于Am ersham o 12方法 1.2.1杂交瘤P35细胞的克隆化培养 在盛有 37?40°C水浴中复苏杂交瘤P-35细胞培养,将第三 次克隆化培养的细胞扩大培养 O 1.2.2抗人肺癌单克隆抗体N35的纯化 初步处理  nol二1:1）和X光胶片放入自显影机显影 SDS纯度鉴定结果如下A图示。W estern blot对N35的特异性进行鉴定如下B图示。单克隆 抗体N35的活性鉴定结果如C图示 I ? ? ° 仅恳水无反应.其有 泳道分 别加的是：1JE常人 三次韵有限稀释克雇化培养 三次韵有限稀释克雇化培养 /J；单抗N 历冋纯化其分泌- -达到弘?网侏 P35细胞培养上清后装。柱、平衡、上样和洗脱 O 1.23单抗N35的纯度鉴定 采用SDS不连续丙烯 酰胺凝胶电泳后用生物软件ToTelLabV：.分析 O 1.2.4 EL1SA法测定单抗N35的活性⑵将GLC?82 I；各型 透阳 鬲织 仅为50%）故可能还须再进行2~3 和淋巴细胞无反应， C 田 A、厲孔无 GLC-82 iiM.AA-jKPBS 祀Q、 二拭,厲、为阴H叶黒?入阳11对无一拭?A?B.无 二抗.其余孔一抗均是第三次尢隆化堆养的P35分泌的上 紳*制耕貳般曉性人胚肺妬器官组 织基本无反应，具有 织基本无反应，具有7 细胞种于96孔酶标板中作为抗原，应用阴性对照 眾器畀常話?了2蟲蠶 系统，一抗为P?35细胞分泌的上清（即第三轮克隆 高特异性 116、97、67、430‘) 化培养的细胞所分泌的单克隆抗体），二抗即1 A! Ai??? 2000的羊抗鼠酶标IgG抗体 125特异性鉴定 用W estem blot对N35的特异 性进行鉴定wo样品准备：收集传代培养的肿瘤 GLC?82、YTLC等用PBS洗涤。将手术切除的肝癌 胃癌、上颌鳞癌、正常上皮和肺组织制成悬液。一吐 为1 :100纯化的单抗N35,二抗为1:500酶标记 的鼠二抗。采用化学发光齐!J ECL （Enharced:lumi- 作者单位：合肥市第三人民医院 合肥230022 2008-06-28 收稿,2008-09-03 修回 B. B? B：. B C图AkB.孔无GLC-82细胞，A B孔用PBS代替一 二抗，A、B＜为阴性对照，AB”阳性对照，无一抗，无 二抗，其余孔一抗均是第三次克险化培养的P35分泌的上 清。图示单抗N35保持良好的免疫活性 3讨论 参考文献 Clone Culture of Hybridoma Cells and Purification of Its Secreting Me Ab Hefei 3rd Peoples Hospital, Hefei 230022,AnhuiWANG Yong-he, WEI Xiana-zhi, HE