第三章毛细管电泳分离技术.ppt

第三章　毛细管电泳分离技术;第一节　概　述;发展历程;1981年，Jorgenson等介绍了毛细管区带电泳技术。 1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。 1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。 1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。 1991年，Monnig等首次提出了高速毛细管电泳。 目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋白质和核酸等离子型生物大分子的分离分析，加入表面活性剂还可以扩大到中性粒子，甚至应用到细胞和病毒等的分离。同时，在小分子化合物的分离分析方面也取得了重大进展。 ;第三章毛细管电泳分离技术;第二节　毛细管电泳基本原理 ;（一）电泳和电渗; 当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速度 与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲溶液 的粘度及带电离子的大小有关。 ;电渗(Electro osmosis)是驱动电解质运动的第二种作用力，它使毛细管中的溶剂在直流电场作用下发生定向运动。;电渗流的产生;固、液两相之间的相对运动发生在吸附层与扩散层之间的滑动面上，此处的电动势称为界面电动势，也称ζ电位。 由于处在扩散层中的正离子的溶剂化作用，它在电场中发生迁移时，将带动整个溶液向阴极移动，所以就形成电渗流（Electro Osmotic Flow, EOF）。 ;电渗流速度Veo与ζ电位、ε、E成正比，而与介质的粘度η成反比。 ;与HPLC柱不同，毛细管中的电渗流呈平面流型，它不存在径向梯度。;电渗流的意义;电解质区带的移动速度(Vi)等于电解质区带的电泳迁移速度(Ve)与溶剂流速度(Veo)之和。 ;当把样品从阳极端注入毛细管时，假设A物质为负离子，B物质为正离子，则带不同电荷的离子将按下面的速度迁移到阴极，到时间t时，A、B物质已经分离了。 正离子：νt =νeo + ν+ 中性分子：νt = νeo 负离子：νt =νeo - νˉ;抑制毛细管中电渗流的办法： 消除固液界面间的ζ电位或提高溶液的粘度； 在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂层。 具体方法有：;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;(二)分离效率和分离度;;2、分离度 电泳中两峰的分离度，也称分辨率，它表明湍度相 近的组分分开的能力，可???达为（和哪些因素有关）：;分离度计算式（具体如何计算）:;（三）区带宽度及展宽因素;2、区带宽度展宽因素;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;（4）电泳扩散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它 地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度 的差异，而引起区带分散。;二、毛细管电泳的分离模式;1、毛细管区带电泳(CZE) ;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;2、胶束电动毛细管电泳(MECC);分离过程：在电场作用下，体相溶液在EOF带动下流向阴极，表面带负电荷的胶束泳动方向与EOF方向相反，一般EOF速度大于胶束泳动速度，因此胶束净迁移向阴极。溶质在流速大的体相水溶液和流速相对较缓慢的假固定相胶束间进行分配。;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;3、毛细管凝胶电泳(CGE);筛分剂;优点：1、毛细管凝胶电泳分离度极高。电泳技术和平板凝胶电泳的结合。 2、电泳峰尖锐，柱效极高。凝胶黏度大，抗对流，溶质扩散减少，限制了谱带展宽。 3、组分在短柱上能有极好的分离。溶质与凝胶可形成络合物，增加了分离度，防止了 溶质在毛细管壁的吸附，减少了电渗流。 缺点: 制备柱较困难，寿命较短。;4、毛细管等电聚焦(CIEF);注意：电渗流的存在会破坏稳定的聚焦区带。 解决方法：通过管壁涂层使电渗流减少到最小，可防止蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带。;第三节　毛细管电泳装置 ;高压电源可对毛细管施加5~50 kV电压，操作电压一般控制在5~30 kV范围。 CE通常使用内径10~100 μm、长12~120 cm (内涂聚酰亚胺) 弹性融凝石英毛细管，毛细管的两端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中，毛细管内也充满同样的缓冲溶液。 被分离试样可以采用流体动力学进样和电动进样方式由毛细管一端进入。 ;一、毛细管电泳的进样技术 ;（一）电动进样;（二）流体动力学进样;二、毛细管电泳检测器;紫外检测器;第三章毛细管电泳分离技术;第三章毛细管电泳分离技术;第四节　毛细管电泳技术的应用研究进展;毛细管电泳技术的应用