幽门螺旋杆菌通过抑制micrornas调控胃癌细胞b7-h1表达的研究.docxVIP

幽门螺旋杆菌通过抑制 microRNAs 调控胃癌细胞 B7-H1表达的研 究 第一部分幽门螺旋杆菌通过抑制 microRNAs调控胃癌细胞 B7-H1 表达目的 : 分析胃癌患者肿瘤组织中 B7-H1 表达情况以及幽门螺旋杆 菌对胃癌细胞系表面 B7-H1 表达情况的影响 , 探讨幽门螺旋杆菌感染 在胃癌的发生与发展过程中调控胃癌细胞 B7-H1 表达的具体机制 , 为 肿瘤治疗提供新的思路。方法 : 收集胃癌患者肿瘤组织标本 , 分析其 B7-H1在肿瘤细胞上的表达情况 , 并且分析肿瘤组织 B7-H1 阳性率与 胃癌患者性别、年龄、分化程度、 TNM分期以及是否感染幽门螺旋杆 菌等因素之间的关系 ; 体外共培养人胃腺癌细胞系 AGS和幽门螺旋杆 , 并加入干扰素 - γ(interferon- γ,IFN- γ), 待 AGS细胞与幽门螺旋杆菌共培养 24 小时后收集细胞 , 用流式细胞术检测幽门螺旋杆菌感染的 AGS细胞以及无幽门螺旋杆菌感染的 AGS细胞的 B7-H1表达水平, 观察幽门螺旋杆菌对 AGS细胞系 B7-H1 表达水平的影响 ; 通过 microRNA芯片技术分析 B7-H1 阳性胃癌细胞和 B7-H1 阴性胃癌细胞 microRNA的表达差异 , 筛选出候选 microRNAs;将筛选出来的 microRNAs mimics 分别转染 AGS细胞 , 并加入 IFN- γ刺激培养转染 mimics 后的 AGS细胞 , 使用流式细胞术检测 AGS细胞在不同 mimics 转然后 B7-H1的表达情况 , 选择出可能调控 B7-H1 表达的 microRNAs; 将筛选出可能调控 B7-H1 表达的 microRNAs转染入 AGS细胞 , 同时使 用相应 microRNAs的抑制剂 , 使用流式细胞术检测相应 B7-H1 表达水 平, 以确定 microRNAs对 B7-H1表达的影响 ; 使用 qRT-PCR检测幽门螺 旋杆菌感染的 AGS细胞以及普通 AGS细胞中 microRNAs的表达水平 , 分析幽门螺旋杆菌感染对 AGS细胞 microRNAs表达的影响 ; 构建双荧 光报告载体 , 验证 microRNA-152 以及 microRNA-200b 靶向作用于 B7-H1的 3U1TR;收集幽门螺旋杆菌阳性胃癌患者肿瘤组织标本 , 通过qPCR检测肿瘤细胞中 microRNA-152 和 microRNA-200b 的表达水平 , 同时使用流式细胞术检测肿瘤细胞 B7-H1 的表达水平 , 分析胃癌肿瘤 组织中 microRNAs水平和 B7-H1 表达水平之间的关系。结果 : 我们通 过收集胃癌患者肿瘤组织标本 , 分析其 B7-H1 在肿瘤细胞上的表达情 , 发现 : 幽门螺旋杆菌阳性胃癌标本中 ,B7-H1 表达为阳性的肿瘤标本占 64.5%,而幽门螺旋杆菌阴性胃癌标本中 ,B7-H1 表达为阳性的肿瘤标本仅为 45.0%; 根据胃癌 TNM分期 , Ⅰ期患者 B7-H1 表达阳性的肿瘤标本占 37.5%,Ⅱ期患者为 47.3%, Ⅲ期患者为 56.4%, Ⅳ期患者为 73.3%; 根据患者肿瘤分化程度 , 高分化肿瘤患者 B7-H1 表达阳性的肿 瘤标本占 55.6%,中低分化肿瘤患者为 59.4%;高龄 ( ≥60 岁) 患者 B7-H1表达阳性的肿瘤标本占 50.0%,非高龄 (lt;60 岁) 患者为 61.4%。 使用用流式细胞术检测幽门螺旋杆菌感染的 AGS细胞以及无幽门螺 旋杆菌感染的 AGS细胞的 B7-H1表达水平 , 发现 : 幽门螺旋杆菌感染的 AGS细胞 B7-H1表达水平明显高于普通 AGS细胞,IFN- γ也能促进 AGS 细胞 B7-H1表达 , 而且幽门螺旋杆菌和 IFN- γ对 AGS细胞的 B7-H1 表达有叠加效应。通过 microRNA芯片筛选 , 并结合靶向预测 , 我们发现 有五个候选 microRNAs可能调控 B7-H1表达 ; 转染相应 mimics 之后发现,microRNA-152 和 microRNA-200b 能显著下调 B7-H1 的表达 ; 在 加入  microRNA-152 mimics  和  microRNA-200b mimics  以及相应抑 制剂共转染时  , 这种下调效应可以被逆转消除。通过实时定量  PCR检 测发现 ,  幽门螺旋杆菌感染的  AGS细胞中 ,microRNA-152  和 microRNA200b表达明显下降  , 同时在幽门螺旋杆菌感染和  IFN- γ的 双重刺激下 ,microRNA-152 和 microRNA200b表达下降更加显著。构