酶的分离纯化.pptVIP

2021/3/17 * 常用的凝胶: 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 2021/3/17 * 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力,而使生物分子分离纯化的技术。 酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体,酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间,都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用. 2021/3/17 * 亲和层析的四个要素 2021/3/17 * 常用的亲和介质及专一性配体 2021/3/17 * 根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为: 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析 2021/3/17 * 疏水层析与反相层析的基本原理 本节 目录 2021/3/17 * 5、电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 电泳方法按其使用的支持体的不同,可以分为: 纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 自由电泳 等电聚焦电泳 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量,同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外,还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。 2021/3/17 * 制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc进行,以便回收具有活性的蛋白质;蛋白质样本要先经过部分纯化,否则效果不佳,并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。 2021/3/17 * 本节 目录 2021/3/17 * 6、萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。 按照两相的组成不同,萃取可以分为: 有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取 2021/3/17 * 各种双水相系统 聚合物P 聚合物Q或盐 聚丙二醇 甲基聚丙二醇,聚乙二醇,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,羟丙基葡聚糖,葡聚糖 聚乙二醇 聚乙烯醇,葡聚糖,聚蔗糖 甲基纤维素 羟甲基葡聚糖,葡聚糖 乙基羟乙基纤维素 葡聚糖 羟丙基葡聚糖 葡聚糖 聚蔗糖 葡聚糖 聚乙二醇 硫酸镁,硫酸铵,硫酸钠,甲酸钠,酒石酸钾钠 2021/3/17 * 某些超临界流体的超临界点和超临界密度 流体名称 临界温度(℃) 临界压力 (Mpa) 临界密度 （g/ml） 乙烷C2H6 32.3 4.88 0.203 丙烷C3H8 96.9 4.26 0.220 丁烷C4H10 152.0 3.80 0.228 戊烷C5H12 296.7 3.28 0.232 乙烯C2H4 9.9 5.12 0.227 氨NH3 132.4 11.28 0.236 二氧化碳 CO2 31.1 7.38 0.46 二氧化硫 SO2 157.6 7.88 0.525 水H2O 374.3 22.11 0.326 笑气N2O 36.5 7.17 0.451 氟里昂C 28.8 3.90 0.578 本节 目录 2021/3/17 * 3.5 酶的组合分离纯化策略 Resolution（分辨率） Speed（速度） Capacity（容量） Recovery（回收率） 设计分离纯化工艺的基本要求 2021/3/17 * 本章 目录 2021/3/17 * 2021/3/17 * Contents of chapter 3 1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取 4、酶的分离方法 Go Go Go Go 5、酶的组合分离纯化策略 Go 6、酶的浓缩、干燥与结晶 Go 2021/3/17 * 细胞结构与酶分布 2021/3/17 * 3.1 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 离心分离,过滤分离,沉淀分离,层析分离,电泳分离,萃取分离,结晶分离等。 2021/3/17 * 酶的纯化过程,约可分为三个阶段: (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白,多使用 盐析沉淀法;可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化,使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化,可用制备式电泳 或 HPLC。 酶分离纯化不同阶段 本章 目录 2021/3/17 * 3.2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶,首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4