大学化学教学课件-分子生物学研究法.pptVIP

分子生物学研究法（上）; 分子生物学从20世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。 基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。; 跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA与RNA操作技术、基因克隆技术以及蛋白质组学等几个分子生物学研究方法的关键环节。;重组DNA技术史上的重大事件; DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。 1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别GAATTC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。;他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。 此后，大量类似于EcoRl 但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。;DNA操作技术核酸的凝胶电泳; 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基??原理。;2.琼脂糖凝胶电泳; 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1～1000bp 之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而若要分离1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%～1.0%)的琼脂糖凝胶。; 在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭(ethidium bromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，DNA带中含0.05μg的微量DNA，可以清晰地检测出来。EB能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子能吸收EB并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。;载 体 一．载体的概念： 1.要把一个有用的基因（目的基因-研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。 3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA ; 二、载体的分类;说明： 1.穿梭载体（sbuttle vector） 指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间，如：YEP,DIDB219 2.YAC Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成，对克隆大的真核基因十分有用，在HGP中发挥主要作用。 3.BAC 细菌人工染色体。 ;三、基因工程载体的3个特点： （一）都能独立自主的复制 载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。 （二）都能便利的加以检测 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带