流式细胞术描述.pptxVIP

流式细胞术Flow cytometry，FCM 基本概念1. 流式细胞仪(Flow Cytometer):是现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备。2. 流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。第一节 流式细胞仪基本结构与原理第二节 流式细胞术的数据分析第三节 流式细胞仪分析的技术要求第四节 流式细胞术的应用第一节 流式细胞仪基本结构与原理 一、流式细胞仪基本结构与功能 二、流式细胞术的重要术语 三、流式细胞术基本原理 四、流式细胞术的样本设置 四、流式细胞术的样本设置1. 常用对照阴性对照阳性对照空白对照补偿对照2.一套完整的流式细胞术检测样本设置阴性对照 作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，即确定待测标本的基础荧光域值免疫球蛋白同型对照（同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白。反映待测标本对抗体非特异性结合的 水平）阴性细胞对照（用已知不表达某种抗原的细胞进行平行实验，通常用于确定抗体的特异性）阳性对照 即用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）细胞进行平行实验，通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。空白对照 即不进行标记的细胞。有些细胞内物质会同样被激发而产生自发荧光。空白对照的主要作用用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。补偿对照 由于光谱的重叠，对于多色分析样本必须设置补偿对照。补偿对照主要用于多色分析时荧光光谱重叠的补偿调节。 补偿对照是将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标记，以测定荧光信号的重叠并作适当调节。2.一套完整的流式细胞术检测样本设置 流式细胞术的基本原理是利用细胞标记前后的荧光强度改变来确定细胞性状，故一套完整流式样本即要有用于确定其基础荧光域值的对照（如空白对照或阴性对照），又要有已标记的待测样本。一套完整的流式样本设置可根据其不同的标记方法进行如下设置。 直接标记样本 对于单色样本应设置空白对照、阴性对照（同型抗体对照）和待测样本。对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。 间接标记样本 对于单色样本应设置空白对照、阴性对照（一抗同型抗体对照）和待测样本。 对于多色样本，在单色基础上另加补偿对照，一般不建议使用。三、流式细胞术基本原理1.流式细胞术分析的基本原理2.流式细胞术分选的基本原理3.流式细胞仪荧光补偿设置1.流式细胞术分析的基本原理前向散射与侧向散射是细胞的固有属性，暂称为物理属性。荧光信号是人们通过不同手段将荧光物质结合在细胞上，是人为属性，暂称为化学属性。R1：淋巴细胞R2：单核细胞R3：粒细胞R4：红细胞裂解碎片和少量血小板 将目的细胞群圈定（即设门），然后将门内细胞以FSC或SSC为横坐标，荧光信号为纵坐标的散点分布图表示出来，此图中细胞会出现在与其FSC或SSC相应的位置，并只可能表现两种情况：荧光信号弱或无、荧光信号强或有。 调节电压可改变目的细胞的荧光信号强弱，那么如何判断特异性荧光信号的有无？ 需要设置阴性对照以确定细胞自身基础荧光域值，并通过它来判断待测样本中是否有特异性荧光信号。 首先通过调节电压将阴性对照细胞的基础荧光域值调至阴性致信区内，然后对阴性置信区进行界定，大于阴性置信区的荧光信号为特异性荧光信号。 对于流式样本来说，设置阴性对照是必须的，且阴性置信区一旦设定，将作为后续样本的阴、阳性判断的基础，不能随意变动。2.流式细胞术分选的基本原理1. 分选速度：几千个细胞/秒2. 分选纯度: 99.5%左右 分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。3. 分选收获率: 90-95% 分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。3.流式细胞仪荧光补偿设置以FITC、PE双色分析为例：（1）先调节阴性对照管（即同型对照IgGFITC、IgGPE）：先将原补偿清零，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE双阴性区。阴性对照的作用是，调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。（2）FITC标记抗体/IgGPE：(IgGPE为同型对照) 此时电压已通过阴性对照设定，绝不能变动。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时，补偿便是正确的，即FITC单阳性细胞的PE信号与阴性对照的PE信号一致。 注：首先要知道双阴性细胞的情况，其次是在检测管中，必须要有FITC单阳性细胞和双阴性细胞。（3）IgGFITC/PE标记抗体：同理，将进入FITC探测器的PE信号降至本底一致，前提是必须有PE单阳性细胞和双阴性细胞。（4）当设置好以上补偿条件后，即补偿调节完毕。（5）进行多色分析时，必须做各荧光间的补偿。方法同上，先准备各种标记的荧光阴性对