基因工程的基本过程分(合成)、切、连、转、选、鉴.pptVIP

;重组DNA连接、转移、筛选与鉴定;1 粘性末端连接;粘性末端连接;; 两个具有平末端的双链DNA分子连接。 问题：低效率、串珠现象；; 利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3‘端各加上一段寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC),制成人工粘性末端； 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA分子。 ;重组DNA连接--同聚物加尾法 ; 将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造粘性末端，再进行连接的方法。 ;连接反应体系（20μl）：;1、反应温度：16度； 2、时间：过夜或1h； 3、DNA量：50-100ng； 4、载体与目的DNA比例 1：8（摩尔比）； 5、酶量 ;重组DNA连接、转移、筛选与鉴定; 接合 (conjugation）：当细胞之间、细菌间通过菌毛相互接触时，质粒DNA 从一个细胞(细菌) 至另一细胞(细菌)的转移。 转导（transduction）：???当病毒（噬菌体）从被感染的(供体)细胞释放出来、再感染另一(受体)细胞时，发生DNA转移及基因重组。 转座(transposition )：有些基因可以从一个位置移动到另一位置，由可移动的DNA 序列（插入序列和转座子）介导。; 基因转移过程中，不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。 包括位点特异性的重组（整合酶催化）和 同源重组两种类型。 发生在同源序列间的同源重组，又称基本重组。 同源重组依赖两分子间序列的相同或相似性，将外源DNA整合进宿主染色体。 ;体外重组DNA的转移;热击法（氯化钙法）;外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。 基因枪(gene gun) 微粒轰击法(microparticle bombardment)： 将载有外源基因的微米/亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。 ;基因工程的基本过程分(合成)、切、连、转、选、鉴;电穿孔(electroporation)转化：;;重组DNA连接、转移、筛选与鉴定;酶切鉴定;;;核酸杂交;基因工程的基本过程分(合成)、切、连、转、选、鉴;1.引起核酸变性的因素： 酸、碱、热、变性剂（尿素、胍） 有机溶剂（乙醇、丙酮） 2.核酸的复性（Renaturation）退火： 互补单链重新缔合成双链的过程。 影响复性速度的因素： DNA大小；离子强度；DNA浓度； ;核酸杂交;Southern 杂交;Southern 杂交;; 能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸序列。 分类: 1. 同位素标记 2. 非同位素标记:地高辛 （digoxygenin, DIG） 标记核酸探针,利用抗 DIG 的抗体通过酶联免疫反应检测。 ; 1.缺口平移法 2.随机引物法 ;基因工程的基本过程分(合成)、切、连、转、选、鉴;Southern blotting;原位杂交;基因工程的基本过程分(合成)、切、连、转、选、鉴;菌落杂交;基因工程的基本过程分(合成)、切、连、转、选、鉴;斑点杂交?;Western Blotting; 加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体）； 二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）； 通过特异性反应显色进行检测。 ;构建基因文库筛选目的基因;;按照外源 DNA 片段的来源，基因文库分为： 基因组 DNA 文库（genomic DNA library）： cDNA 文库（complementary DNA library）： cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA， 再将这些cDNA与合适的载体重组后导入宿主细胞。，这一组重组子带有该种生物的所有蛋白的编码基因。 ;基因组文库构建;基因组文库构建过程：;;;文库筛选：;基因工程的基本过程分(合成)、切、连、转、选、鉴;2. 菌液PCR;通过自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。 根据分子间的特异作用的原理，实现对细胞、蛋白质、基因等生物组分的准确、快速、大信息量的检测。;基因芯片（DNA 芯片）：;微型化：每平方厘米固体表面上可固定十万个 DNA 片段、数万个基因。一次分析可得到数万个基因的表达信息。 样品用量与试剂用量的微量化，纳克级的 mRNA 、微升级的杂交液。??? 自动化?：芯片制作及分析过程，杂交、洗片、芯片结果读取与扫描与数据处理 都可实现自动化，