分子生物学实验4重组质粒DNA酶切反应解析.docVIP

实验四 重组质粒 DNA 的酶切反应 实验目的 掌握用限制性内切酶切割 DNA 片段基本实验技术，了解限制性内切酶的作用。 实验内容 用限制性内切酶切割载体，然后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。 一、 实验材料 含目的片段的质粒 T＋P DNA ；限制性内切酶 EcoR I 和 HindIII 及相应的反应缓冲液； 0.5 ×TAE 电泳缓冲液； 6×电泳上样缓冲液 二、 主要设备 台式高速离心机，恒温水浴锅，微量加样器，电泳仪，紫外成像仪 三、 操作步骤 （一） DNA 酶切反应 1、 将清洁干燥并经灭菌的 0.5ml EP 管编号 2、 按下表次序加入反应混合物。 编号 质粒 DNA 10×Buffer 纯水 EcoR I HindIII 总体积 1 16ul 4ul 16ul 2ul 2ul 40ul 3、 混匀后，于 37℃水浴保温 3 小时，使酶切反应完全。 4、 置于 -20℃冰箱中保存备用。 （二）琼脂糖凝胶的制备及电泳 1、 电泳：取 40ul 反应液与 8ul 上样缓冲液混合，然后进行琼脂糖凝胶电泳。将没有酶切的质粒和 Marker C DNA 分别取 2ul 上样，做对照和分子量标记。 2、 观察：用紫外成像仪观察电泳结果。