深入实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定.pptVIP

五、实验的主要仪器 1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm);;七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处理一步外，尽可能低温） 第一部分 样品的制备： 1.称取10.0克干酵母粉于研钵内，加3.0克石英砂， 10ml buff（先量取总体积buff30 ml），在研钵内研磨成糊状，约30分钟，再分次加buff 10ml并研磨10分钟，, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管，12000r/min离心10分钟，取上清液，并量取体积，留1.0ml 上清液(定为第一步骤的样品Ⅰ)，用于测定酶活力和蛋白浓度。;2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留1.0ml (Ⅱ样品)测定此酶活力和蛋白浓度。 3.酒精沉淀 将热处理后的上清液，加入相同体积的-20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！！！）放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff(Ⅲ样品，留1.0 ml样液测活)，