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绿原酸抗疱疹病毒作用及其机制研究 山东大学药学院 张玉生 2008-04-28 主要内容 1 立题依据 2 项目的研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题 3 实验研究方案及可行性分析 4 本项目的特色与创新之处 5 已完成的工作 6 研究进度安排 立题依据 以鱼腥草注射液为集中表现的严重不良反应，成为中药注射剂面临的严竣挑战，并有可能被市场淘汰。因此，中药注射剂安全性研究成为摆在药物毒理学面前的重大而急迫的课题。 图1 中药不同剂型的不良反应  图2 中药注射剂不良反应的情况 注射用双黄连是国家医保甲类药物，集抗病毒、抑菌、提高免疫功能为一体，具有清热解毒、辛凉解表、抗菌消炎等作用，其功效明显强于其他抗病毒类中药制剂。目前已知的活性成分主要有绿原酸、黄芩苷、连翘苷。 可见，目前抗疱疹病毒药物存在较多的不良反应。因此，筛选出具有高效，低毒的药物具有重要的意义。 本实验室体外肥大细胞释放组胺研究未见绿原酸具有诱导类过敏反应的作用。 文献资料检索未见有绿原酸单体抗病毒作用及其机制的研究。 综上所述，开展绿原酸的抗疱疹病毒作用及其作用机制的研究具有重要的理论意义和应用价值。 阿昔洛韦不良反应 靳胜燕.阿昔洛韦致不良反应中文文献分析 中国保健，2006 二、实验的研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题 （一） 研究的主要内容 1、体外抗疱疹病毒作用 2、体内抗疱疹病毒作用 3、抗疱疹病毒作用机制的研究 1 体外抗疱疹病毒作用 1.1 疱疹病毒滴度的测定 1.2 绿原酸的细胞毒性— 确定最大无毒剂量TD0 1.3 绿原酸对病毒增值抑制作用— 检测最小抗病毒的有效剂量(MIC) 1.4 计算治疗指数（SI） 依据公式：SI=TD0/MIC 2 体内抗疱疹病毒作用 2.1 绿原酸对小鼠的急性毒性测定—— 半数致死浓度(LD50)测定 2.2 绿原酸对疱疹病毒感染角膜炎的保护作用 2.3 绿原酸对疱疹病毒感染脑损伤的保护作用 3、抗疱疹病毒作用机制的研究 3.1 绿原酸对病毒的直接杀伤作用 3.2 绿原酸预处理对病毒的阻断作用 3.3 绿原酸对病毒吸附的抑制作用 3.4 绿原酸对病毒穿入的抑制作用 （二）研究的目标 （三）拟解决的关键问题 三、实验的研究方案及可行性分析 （一）实验的研究方案 １ 体外抗疱疹病毒作用 实验材料： 病毒株：Ⅰ型单纯疱疹病毒SM44株 （HSV-1） 细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21） 阳性对照药：阿昔洛韦 1.1 疱疹病毒滴度的测定 将HSV-1连续10倍递次稀释为10-1—10-7 将各稀释度的病毒接种于细胞中，每孔50μl，于37 ℃吸附1.5h后弃上清 用RPMI-1640液洗3遍，加入维持液继续培养，设正常细胞对照组 逐日观察病毒致细胞病变（CPE），记录病变程度 根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50 1.2 绿原酸细胞毒性测定 将BHK-21接种于96孔板。 用不同浓度的绿原酸处理细胞。每一浓度设5个复孔。 置37℃培养箱中连续培养120h。观察细胞的死亡情况。 3、绿原酸对病毒增殖的抑制作用 培养BHK-21细胞 将病毒液接种至细胞，每孔接种50 μl 37℃吸附1.5 h后弃上清，洗涤3遍 每孔加入不同浓度的绿原酸150 μl，实验设5个复孔 置37℃培养箱中培养，每日观察CPE，当病毒对照达到“++++”时，判定结果 2 体内抗疱疹病毒作用 实验材料： 病毒株：Ⅰ型单纯疱疹病毒SM44株 （HSV-1） 细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21） 实验动物：BALB/c小鼠（SPF级） 阳性对照药：阿昔洛韦 麻醉药：戊巴比妥钠 2.1 绿原酸对小鼠的急性毒性测定 给药剂量：通过预实验确定剂量范围 动物组别：给药组5组、溶媒对照组。 给药途径：尾静脉注射 给药体积：20ml/kg 状态观察：连续观察14d，记录小鼠死亡情况 统计方法：采用Bliss法计算LD50值 参照标准：《化学药物急性毒性试验技术指导原则》 2.2 绿原酸对疱疹病毒感染角膜炎的保护作用 动物分组：药物注射给药高、中、低剂量组；药物点眼高、中、低剂量组；模型对照组、正常对照组 给药剂量： 高剂量组：1/4~1/8 LD50值 低剂量组：1/16~1/24 LD50值 中剂量组：高低剂量按等比计算获得中剂量组 麻醉：戊巴比妥钠麻醉 感染：小鼠右侧眼角和耳根连线中点进针2~3mm，有落空感后注射HSV-1 3μl，病毒浓度：100TCID50 给药：感染后24h给药，连续给药7d 病变观察：每天在裂隙灯下观察，记录病变出现的时间，