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透射电子显微镜生物制品制备技术 ;电镜超薄切片;电镜超薄切片;电镜超薄切片;;冷冻蚀刻法 冷冻割断术;细胞化学法;免疫组织化学技术 免疫电镜法;电镜放射自显影术 放射自显影技术;扫描电镜技术;现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类:
一类是透射电镜的基本制备技术,包括超薄切片和负染色法;
另一类是生物制品的特殊技术,其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、细胞化学法、免疫电镜法、放射自显影技术、X线微区分析技术等。
;1、????? 超薄切片样品的制备
(1)?? 取材 基本要求是在活体情况下进行
取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则)
1)? 快速:1分钟之内投入固定液。
2)?? 块小:0.5-1mm3或截面1mm2的长条。
3)?? 部位准
4)? 损伤小:器械应锐利,避免牵拉、挤压,防止组织受机械损伤。
5)??? 低温:0-4oC
;取材的方法
1)动物材料:
对神经组织等要进行原位固定或灌注固定,待组织适当硬化后再取材。;;2)培养细胞: 生长在瓶中的细胞到足够的量,先倒去培养液,然后倒入适量的戊二醛固定液,在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞,将这种混合液倒入离心管中,2000rpm低速离心15-20分钟,使细胞呈团,弃去上清液,换一次固定液,将其移入修块台,修快成标准块4oC固定、待用。;3)单细胞悬液:精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料,可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液,轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定
处理后再离心成团,
在50oC中弃去上清液,
加入适量的经50oC
预温的2%的琼浆,
使团悬浮,将悬浮团
和琼脂液一同在薄片
上展层,固定后
切成1mm3的小块。;(2)固定
固定的目地是把细胞在活体状态时的结构尽可能完整的保存下来,避免自身酶的分解而出现自溶,或外界微生物的侵入而产生腐败,致细胞的超微结构破坏。
;1)固定液的作用; 理想的固定剂,应具备以下条件:①能迅速而均匀地渗入组织细胞内部,稳定细胞内各种成分;②能即刻将细胞“杀死”,尽可能保持细胞微细结构,减少死后变化;③对细胞不产生收缩及膨胀作用,不产生人工??象及变形;④可保存酶的活性,以利于细胞化学测定工作的进行。
;2)影响固定效果的因素
固定液的酸碱度(pH值)
①固定液的pH值
②渗透压
③缓冲液的类型
④固定的温度和时间
当前采用的是在0~4℃下固定1 ~ 4小时。
;3)常用的几种固定剂
A 四氧化锇(osmium tetroxide,OsO4)亦称锇酸:锇酸实际上不是酸,它的水溶液是中性的,为一种强氧化剂。0.5-1g包装,淡黄色晶体。具有挥发性和毒性,在室温下易挥发,其蒸气对粘膜有刺激作用,在通风橱内径相配制。;?优点①对蛋白质和脂类固定较好。②对作为细胞骨架的磷酸脂蛋白的作用好,对核蛋白保护作用很好,因为在有机体内核酸和碳水化合物与蛋白制成复合的形式,因此锇酸几乎和所有的细胞成分结合。③分子密度高,产生良好的反差,因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。
缺点①不能固定糖元和核酸,对微管固定较差。②扩散慢,穿透能力差。③具有挥发性和粘膜毒性。④不适于进行细胞化学工作。
;B戊二醛(glutaraldehyde,C5H8O2)
纯的容易聚合,目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质,影响固定。
优点 (1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性,对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间,适用于进行超微细胞化学研究。 ;C 甲醛(fomaldehyde):多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小,渗透力强,固定迅速,对酶的活性保存好。 ;;2)固定的方法
A 单固定法:对单细胞或固定液易于浸透的组织,一般单独用1-2%四氧化锇固定液固定1-2小时可达到固定的目地。
B 双固定法:戊二醛(2.5% 4oC 2h)---锇酸(1% 4oC 2h)。
C 原位固定和灌注固定:将动物麻醉、解剖进行原位固定。灌注固定:通过血液循环将醛类的固定液灌流到所需组织中。神经组织、视网膜、肾脏。;附 几种常见固定剂的配制
固定液的PH值6.0-8.0,常用PH值7.2-7.4,对含水较多的组织可用PH值8.0,细菌、病毒可用PH值在7.0以下。
0.? 2mol/L磷酸缓冲液的配制
磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6g
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29g
重蒸水 加到500ml
调PH到7.4
;0.2mol/L二甲坤酸盐酸缓冲液
重蒸水
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