基因工程的理论基础与基本技术.pptxVIP

第二节基因工程的基本技术;1、有毒试剂;2、紫外线 紫外分析仪 紫外灭菌;需注意防止污染;仪器的正确操作;由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。;;plasmid DNA;闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；;;（2） 所用的试剂作用;;冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。;;;（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 ;溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。;最重要的是：;这是直接决定DNA产量的重要因素之一。;若干常用质粒的理论产量;（二）、基因组或其他DNA的提取; 一般过程及原理： ;; 一般过程及原理：;0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 ℃温育。;（5）除去RNA污染; 一般过程及原理： ;CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。巯基乙醇作为还原剂使多酚氧化酶失活，可以防止酚类的氧化。;;（三）、DNA的定量和纯度测定;;浓度测定步骤;衡量提取DNA 的纯度;溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。;一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。;DNA ladder; 自从琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶被引进核酸研究以来，凝胶电泳已经发展成为一种分析重组DNA分子的重要技术手段，同时也被广泛地应用于DNA 的核酸内切酶消化片段的分析、分离和纯化以及蛋白质的分析和纯化等方面的工作。 ;1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 ;;Relaxed ;;;（二 ）、琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖的浓度（%）;带电颗粒在电场作用下移动的速度叫做电泳迁移率。（1）DNA分子的大小。 （2）DNA的构象。 （3）琼脂糖浓度。 （4）溴化乙锭使DNA迁移率下降15%。 （5）电压。 （6）电泳缓冲液的成分及浓度。;优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。;（四）、凝胶染色;EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。;;;UVP全自动凝胶成像分析系统;OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统;（五）、聚丙烯酰胺凝胶银盐染色法;具体步骤;DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。;（一）、Southern blot;;;Southern blot 筛选结果;（二）、Northern blot;（三)、 原位杂交;;四 基因扩增技术---PCR;;生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。;（1）;;（3）Taq DNA 聚合酶;;PCR仪;2. PCR技术的原理;双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。;TGCATGCAT;DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。;理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。;3. PCR的过程;;第二步——第三步——第四步;PCR仪的温度循环程序;;需要的模板量极低。;RT-PCR：;自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 ℃ )，PCR技术才进入实用阶段。;最适温度： 75-80 ℃ 延伸速度： 约35-150nt/s.酶分子 最长延伸长度：6.7kb;金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。;（2）其它耐热的 DNA聚合酶 ;;与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5 ’端相同）的短DNA。;即2.75?1011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。;③引物的碱基序列 ;尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力，碱基随机分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右。;; 4） 引物3`端碱基最好选T,C,G而不选A,这样有利