聚丙烯酰胺凝胶电泳即垂直电泳仪操作步骤.docVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳即垂直电泳仪操作步骤 　一、实验原理 　在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。 　SSCP与变性凝胶电泳基本一致，聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤不同之处有以下几点： 　a.SSCP使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。常用8%非变性胶（丙烯酰胺 80g，N- N，-亚甲双丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L） 　b.工作环境，由于SSCP受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V，电流50mA，单板电泳功率为9W，不用预热。缓冲液最好用新配制的。 　c.由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25℃以下。 　聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb的DNA片段和DNA序列。 　试剂准备 　30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N-N，-亚甲双丙酰胺 1g。加水至100ml，40C棕色瓶可保存2个月 　5*TEB缓冲液：TRIS碱 54g 硼酸 27.5g EDTA 3.72g 加水至1L。 　二、跑胶步骤 　从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶 　2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净 　2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干 　2.4 用乙醇擦洗玻璃板 　2.5 带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀） 　2.6 面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平 　2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位 　2.8 室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔（否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形） 　2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽 　2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。 　2.11 点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。 　2.12枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。 　2.13 电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染 　3. 电泳后的银染检测 　3.1 原理： 　影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。 　3.2 银染 　银染液的配制：称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水 　银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。 　将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。 　3.3 显影 　显影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml 　显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里（显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行）显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。 　将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。