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实验一 微生物培养基的配制和灭菌
培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质,用人工方法配制而成的各种营养基质。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件:(1)适当组分和比例的营养物质;(2)适宜的pH值;(3)合适的渗透压;(4)保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物工作者的主要技术操作之一。
一、实验目的与耍求:
1.了解培养基的配制原理和方法,掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法,掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。
二、实验原理与材料:
(一) 培养基的种类
根据培养基的组成成分,可将培养基分为三类:合成培养基:由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
半合成培养基:由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。
天然培养基:利用天然来源的有机物配制而成的。
从培养基的物理状态来分:
液体培养基:不加凝固剂。
固体培养基:在液体培养基中加2%左右的凝固剂。
半固体培养基:在液体培养基中加入0.2%一0.5%凝固剂。
微生物最常用的凝固剂为琼脂(其次为明胶),又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质,只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。是一种多糖类化合物,主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐,琼脂是一种可逆性胶体,在常规浓度下加热到96℃以上即成溶胶状态,融化的琼脂,当温度下降到42℃
表3-1 琼脂与明胶特性比较
比较项目
琼 脂
明 胶
比较项目
琼 脂
明 胶
熔点(℃)
凝固点(℃)
酸碱度
灰 分(%)
氧化钙(%)
氯化镁(%)
氮(%)
96
40
微酸
16.0
1.15
O.77
O.40
25
20
酸性
14.0—15.0
0.0
0.0
18.3
微生物可利用性
耐热性
来 源
化学本质
常用浓度(%)
绝大多数微生物不能水解利用
强
植物
多糖
1.5—2
部分微生物能水解利用
弱
动物
蛋白质
5一12
(二)实验材料
1.药品:牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂;马铃薯,蔗糖;可溶性淀粉、K2HPO4、
KN03,MgS04·7H20、FeSO4·7H20、等。
2.高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌。
3.其它:天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。
三、实验方法与步骤:
(一)、培养基的配置
1.培养基的配制常用方法和步骤:
(1)称量:按照培养基配方,正确称取各种原料放于搪瓷杯中。
(2)溶化:在搪瓷杯中加入所需水量(根据实验需要加入蒸馏水或自来水),用玻棒搅匀,加热溶解。
(3)调pH值(调pH也可以在加琼脂后再调),用1N NaOH或1N HCl调pH,用pH试纸对照。
(4)加琼脂熔化,在琼脂熔化过程中,需不断搅拌,并控制火力不要使培养基溢出或烧焦,待完全熔化后,补足所失水分,一般数量少,时间短不必补水。
(5)分装:在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装,一般制斜面的装量为管高的五分之一。
特别注意不要使培养基粘污在管(瓶)口上以免浸湿棉塞,引起污染。
(6)包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后,塞上棉塞,用防水纸包扎成捆,挂上所配培养基名称的标签。
(7)灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的,应在下磅后取出,摆成斜面,(见图3一1)。培养基经灭菌后,必须放在37℃恒温培养箱中培养24小时,如确无菌生长,方可使用。
2.三种培养基的配方及配制
(1).牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(用于分离和培养细菌,是一种天然培养基)。
配方: 牛肉膏 3克
蛋白胨 5克
氯化钠 3克
琼脂 20克
自来水 1000毫升
pH 7.2~7.4
灭菌 15磅/英寸2,30分钟。
本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下:30%牛肉膏、5
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