对感染嗜水气单胞菌的日本沼虾成活率的影响及其可能的机制.docxVIP

III III I I IIIIIIII II I IMIIIIIHII Y2223285 摘要 日本沼虾(Macrobrachium nipponense)是我国重要的淡水甲壳类，随着养殖规模的 扩大以及发病率的逐年增加，对其自身免疫机能的研究越来越受到关注。我们前期研究 发现，咪唑类物质KK．42能提高凡纳滨对虾(Penaeus sehmitti)虾苗的成活率。为了探 究该类物质是否对日本沼虾也有类似的作用，本文首先研究了KK．42处理对日本沼虾感 染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后成活率的影响，进一步观察肝胰腺组织形态 变化，分析体液免疫因子0【2．巨球蛋白(alpha2．macroglobulin，a2M))fll几丁质酶(chitinase， Chi)的表达变化，为阐明KK．42的作用机制提供资料。 将体长3．5～5．0 cm的同本沼虾600尾随即分成3组：实验组、对照组和空白组， 其中，实验组用1．95x104 mol／L的KK．42溶液浸泡处理1 min，对照组用不含KK．42 溶液做相同的处理，空白组不做处理；12 h后向腹部第二肌节注射嗜水气单胞菌，空白 组注射等量的生理盐水，观察48 h内同本沼虾的死亡数量，计算成活率；同时，于不同 时间分别从实验组和对照组抽取血淋巴、解剖肝胰腺等组织，用于后续实验。采用常规 石蜡切片技术观察肝胰腺的组织学变化，Real—time PCR方法测定a2M、Chi mRNA水 平，分光光度法测定a2M、Chi活性。结果如下： 实验期间，空白组成活率在90％以上(个别虾因蜕皮死亡)。注射嗜水气单胞菌后， 对照组成活率迅速下降，在24 h成活率最低并趋向稳定；实验组成活率在6、12、24 h 内比对照组增高了25％、141％和133％，呈显著或极显著差异(氏0．05，P0．01)。 组织学观察显示，对照组在0 h肝小管轮廓清晰，F一细胞易分辨；在6 h肝小管管 腔增大，可见较多絮状物；12 h肝小管受损较重，空泡较多且体积较大；24 h肝小管轮 廓相对清晰，部分有空泡。实验组在6 h肝小管管腔体积相对较小；在12 h部分肝小管 受损；在24 h肝小管形态和0 h基本相似。 首次从同本沼虾克隆出的0【2M的部分cDNA序列，经在线BLAST比对，与罗氏沼 虾(Macrobrachium rosenbergii)a2M具有90％以上同源性。Real．time PCR结果显示， ot2M mRNA在血细胞中的表达量最高；在蜕皮周期过程中，血细胞a2M表达水平在蜕 皮自订期(D)最高，蜕皮后期(A、B)和蜕皮问期(C)相对较低。KK．42处理可显著 诱导肝胰腺Q2M mRNA的表达，在处理后6～48 h，mRNA水平与对照组相比极显著升 高(P0．01)，但血细胞a2M 高(P0．01)，但血细胞a2M mRNA水平与对照组相比无显著性差异。注射嗜水气单胞 菌后，对照组血细胞和肝胰腺q2M mRNA水平分别在3 h和3、6、12、48 h显著升高 (P0．05)；实验组血细胞和肝胰腺a2M mRNA含量分别在6、12、48 h和12 h显著高 于相应对照组。血淋巴中a2M活力与其mRNA表达具有相似的模式。 首次从日本沼虾克隆出几丁质酶(Mnchi。3)的部分eDNA序列，经氨基酸序列分 析发现，其序列为几丁质酶GHl8催化域中的一部分，含活性催化中心．LDGLDMDWE． 及保守性的谷氨酸残基，与其它物种相似性达90％。Real．time PCR结果显示，Mnchi．3 mRNA在肝胰腺的表达量最高，表皮也有微量表达；在蜕皮周期过程中，Mnchi．3 mRNA 水平在D2／D3期最高。KK．42处理后12 h，Mnchi．3 mRNA表达量比相应对照组增高 了150％(氏O．05)。注射嗜水气单胞菌后，对照组Mnchi．3 mRNA水平在3 h时显著 升高，实验组mRNA表达量在12、24和48 h比相应对照组分别增高了127％、304％ 和120％(氏0．05)，酶活力在24 h时与相应的对照组比显著增高(氏O．05)。 结论：咪唑类物质KK．42能够提高同本沼虾感染嗜水气单胞菌后的成活率，降低嗜 水气单胞菌对肝胰腺的损伤程度，可诱导cL2．巨球蛋白、几丁质酶基因表达及其酶活力。 关键词：KK．42，同本沼虾，肝胰腺，a2．巨球蛋白，几丁质酶 ABSTRACTMacrobrachium ABSTRACT Macrobrachium nipponense is an important freshwater species for aquaculture in China．With the rapid production and developmen