经典单克隆抗体技术.ppt

经典单克隆抗体技术 单克隆抗体技术 讲授提纲 多克隆抗体的概念 单克隆抗体的概念 单克隆抗体的制备 单克隆抗体的应用 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。 每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。 多克隆抗体 (Polyclonal antibody) 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体。 抗原决定簇：是指抗原分子中决定抗原特异性的特 殊化学基团，又称表位(epitope)。 表位A 表位B 表位C 抗原 克隆A 克隆B 克隆C 多克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb） 通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团。 B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 杂交瘤技术 通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。 单克隆抗体制备原理 用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基对融合细胞进行培养和筛选。 HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。 单克隆抗体制备原理 - - - - - HAT培养基的选择原理 ⑴ 氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。 ⑵ 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。 ⑶ B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5~7d，且功能下降)。 ⑷ 融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。 在HAT选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。 HAT选择培养原理 核苷酸从头合成途径（de novo synthesis） 核苷酸补救合成途径（salvage synthesis） HAT 核苷酸 DNA 氨基碟呤（A） 次黄嘌呤（H） 胸腺嘧啶核苷（T） 单克隆抗体杂交瘤技术基本流程 单克隆抗体的制备步骤 1. 免疫原的制备 颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等 分子量大于5000Da生物物质。 可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。 可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。 2. 免疫动物 可溶性抗原（蛋白质） 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做