生物大分子提取技术.ppt

*;桂花赞;精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”;生物大分子分离纯化的意义;中心法则;核酸、蛋白质（酶）是重要的生物大分子 存在于一切生物体中 核酸是遗传信息的携带者 在有机体内指导各种蛋白质的合成。 蛋白质是生物功能的执行者 担负着生物催化、物质运输、运动、防御、生长调控以及记忆、识别等多种生理功能。;核酸-DNA与RNA结构;;A-T对 G-C对;;核酸的性质;蛋白质结构;*;蛋白质性质;生物大分子分离纯化的一般程序;一、材料的选择与预处理;应选择适当的方法将组织和细胞破碎，生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态和生物活性。 但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。; 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。 ;细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 采用差速离心法分离细胞器，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。;将组织细胞破碎，使目标分子被释放出来，并将其与其它细胞成分分离, 这就是提取。 在此过程中，必须立即将细胞匀浆液置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置???成制备物的分解破坏，;从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。 ;核酸分离纯化的一般程序 ;核酸提取技术;核酸提取的要求;DNA的提取纯化;举例:外周血DNA提取的方法步骤;3. 酚抽提纯化DNA： 冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。 4. 沉淀DNA： 加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的冷无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液适量溶解DNA ，DNA完全溶解通常需12-24小时。;5. DNA的浓度测定及纯度判定： 取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。按下面公式计算浓度： DNA浓度(ug/ul)= A260*50*稀释倍数/1000 DNA纯度的判定： A260/A280 比值应介于1.7-1.8之间。;人基因组DNA ;RNA的提取纯化;关键点: １）样品细胞或组织的有效破碎； ２）有效地使核蛋白复合体变性； ３）对内源ＲＮＡ酶的有效抑制； ４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离； 5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。;RNA的提取途径： 1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；该提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前已很少使用。 2)直接在酸性条件下用酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀，再用乙醇洗涤沉淀，即可去除几乎所有残留的蛋白质和无机盐 。 因为酸性条件下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。 ;举例：组织（细胞）总RNA提取; 2 操作步骤 1）将10-30mg组织加入1ml RNA提取缓冲液，匀浆化；或将1ml RNA提取缓冲液加入1瓶培养细胞（10E6-10E7细胞），充分混匀，并使细胞