《细胞工程》第4章(3)动物细胞培养工程4.pptx

细胞工程Cell EngineeringChapter 4、动物细胞培养工程 4．1 概述 4．2 生产用动物细胞系4．3 培养液和培养环境4．4 动物细胞培养工艺4．5 动物细胞培养过程的放大与优化4．6 动物细胞代谢工程4．7 动物细胞工程产品制备及质控4．8 动物细胞工程表达产品的应用4．5 动物细胞培养过程的 放大与优化4．5．1 动物细胞培养工艺的研究A、开发重要性： 真核细胞表达产物糖基化，有疗效； 动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白药物，2.6g/人、年×6154美元/g=16000美元，2002年，销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优化生产工艺，提高产量。B、主要内容： 生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。C、初步研究： 首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细胞培养工艺。4．5．2 动物细胞培养工艺的优化A、影响蛋白质产量的关键参数， 营养物耗尽；B、决定细胞浓度 有毒废物的积累 的关键参数 培养物理条件的恶化 提高蛋白质表达水平C、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制 优化策略 流加工艺的优化4．5．3 动物细胞培养工艺的放大A、生物反应器尺寸放大 鼓泡B、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法 搅拌速率和搅拌器的设计C、混合 剪切力和细胞损伤D、工业生产中的动物细胞培养 4．6 动物细胞代谢工程4．6．1 概述 A、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳，需要对细胞代谢途径进行修饰；B、代谢控制发酵（metabolic control fermentetion）——是指利用遗传学或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵；C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出和形成了“代谢工程”概念；D、代谢工程（也称途径工程，pathway engineering）——是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络有目的地被修饰。4．6．2 基本原理A、代谢网络理论细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又互相协调；代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔性节点；柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断； 生物合成相关代谢调节和调节网络理论代谢工程 代谢流及节点分析 理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析B、代谢流及中间产物分析——静态分析C、代谢控制分析——动态分析4．6．3 代谢调节的基本类型及其机制A、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制 合作反馈控制 累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制B、酶合成及酶活性的调节机制 末端代谢产物阻遏酶的阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏和酶的诱导 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工 多功能酶 4．6．4 代谢工程的研究方法 A、设计思路改变代谢流 扩展代谢途径和构建新的代谢途径 常规方法——分子生物、生化、物化 代谢通量分析（MFA）— 静态B、研究 代谢控制分析（MCA）— 动态 方法 代谢网络 生化系统理论（BST）— 最优化原理 定量分析 控制论模型（CM）— 非线性 途径分析——途径定位 细胞代谢模型C、代谢模型的 发展与优化神经网络 计算生物学方法 遗传算法 D、逆代谢工程 4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．7．1 动物细胞工程产品制备 A、初级分离——离心、过滤、吸附 B、纯化——色谱法 C、制剂与冷冻干燥4．7．2 动物细胞工程产品的质量控制 PAGE 纯度SDS液相色谱 A、物化指标测定 含量 B、安全性评介 分子量 C、稳定性 4．8 动物细胞工程表达产品的应用 4．8．1 重组蛋白药物 A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体 Tenecteplase，商品名TNKaseTM， 急性心肌梗死病人溶栓治疗， 人t-PA基因位于8