第三章基因工程制药.pptx

第五节 基因工程菌生长代谢的特点;一、菌体的生长与能量的关系; 分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。 ;;二、菌体生长与前体供应的关系; 质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 ; “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延深过程减少转录。; 它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。;第六节 基因工程菌的不稳定性;分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定 比例不含质粒子代菌的现象。 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 ;一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素： ⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； ⑵这两种菌比数率差异的大小。;;质粒稳定性的分析方法;二、提高质粒稳定性的方法; 由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。 调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度; 有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。 ; 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的和成和菌体的生长。 ;第七节 基因工程菌中试;一 工程菌选择 用于中试的工程菌需具备的条件试能用一般基因重组技术获得，有高产潜力，能有工业原料薇培养基，生产工期能采用一般工业生产经验，能产生和分泌蛋白质，不致病，无毒性，能安全生产，符合国家卫生部门有关规定，产品有特异性，发酵液粘度小。;二 反应器设计 三 发酵培养基组成 培养基组成及作用： 提供化学元素 提供特殊营养源 提供能源 控制代谢 ;四 工艺最佳化与参数监测控制 1.工艺最佳化 是指最快周期，最高产量，最好质量，最低消耗，最大安全性，最周全的服务处理效果，最佳化速度与最低失败率等的综合指标 2.参数监测控制 需监测与控制的4种参数：A，主要参数：pH,温度，溶氧。B，生物量：浑浊度，细胞组分，总氮量及菌丝干重。C，碳源：糖，有机酸，淀粉。D，产品。 ;五 计算机的应用;第八节 重组工程菌的培养;; 一 基因工程菌的培养方式 1. 分批培养 2. 补料分批培养 3. 连续培养 4. 透析培养 5. 固定化培养;;二、基因工程菌的培养工艺; 工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶氧量的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响;;;;; 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 ;⒊ 温度的影响;;⒋ 溶解氧的影响;;⒌ 诱导时机的影响;;7 pH的影响;;;三、基因工程菌的培养设备;;;;第九节 高密度发酵;高密度发酵是一个相对概念，一般指培养基中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L;一 影响高密度发酵的因素;二 实现高密度发酵的方法;第十节 基因工程药物的分离纯化;;一、建立分离纯化工艺的根据;;二 、分离纯化的基本过程;三、分离纯化的技术;;;⒉目的产物的分离纯化;⒉目的产物的分离纯化;;分离纯化的方法依赖色谱分离方法;⑵反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）和 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）; 常用固定相为硅胶烷基键合相。 流动