第七章 工业微生物诱变育种.pptVIP

第七章???工业微生物诱变育种;2;4;5;第一节 诱变育种的试验设计和准备工作;一、 诱变前对出发菌株的了解;注：培养基Ⅰ(%):淀粉8、糊精4、黄豆饼粉2、玉米浆0.4、硫酸铵1.2、碳酸钙1.2、氯化钠0.4、磷酸二氢钾0.01、氯化钴10μg/ml、玉米油2.5；培养基Ⅱ(%):除糊精7、硫酸铵1.4、碳酸钙1.4、合成消泡剂0.02-0.03代替玉米油，其他成分与培养基Ⅰ相同。;二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系;2.培养基斜面制备技术 一个好的培养基配方固然很重要，但忽视配制技术也会造成菌种生长不良，甚至发生变异、退化，直接影响菌种质量和生产水平。 注意药品的原材料质量、规格，要相对稳定。 培养基蒸汽消毒时，压力、时间要适宜，不能超压、超时灭菌。;4.温度;6.药品和原材料质量;六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件 一个优良菌种的获得往往要花费巨大的人力、物力和时间，是非常不容易的，不能随便采用某个培养基、培养条件和保藏方法进行培养和保藏。;第二节 诱变育种的步骤与方法;一、出发菌株;（4）由于有些菌株在发生某一变异后会提高对其他诱变因素的敏感性，故有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌株中，曾发现以分泌黄色色素的菌株作出发菌株时，只会使产量下降，而以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量会不断提高；;（6）在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑至少能累计少量所需产物或其前体的菌株，而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。;4.选择出发菌株应考虑其稳定性;表-7.2 灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系;表-7.3 头孢菌素C产生菌C-20诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系;6. 选择出发菌株的其他因素 要选择具有产孢子较多、不产或少产色素、生活能力强、生长速度快、周期短以及糖氮利用快、耐消泡、黏度小等性状的菌株作为出发菌株，总之，要尽量符合育种所需要的生物学和代谢的特性。;8. 菌种代谢特点 了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 如，有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸降解酶及核苷酸、磷酸化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作为诱变出发菌株，一般能得到良好的诱变效果。;二、出发菌株的纯化 确定诱变出发菌株之后，就要进行纯化。因为微生物容易发生变异和染菌；一般丝状菌的野生菌株为异核体；生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变产生变株等。这些都会造成遗传性状不稳定。 常用划线分离法、稀释分离法、单孢子分离法 在诱变育种中，出发菌株的纯化虽然是辅助手段，但它是不可缺少的技术步骤，其效果是显著的，例如从表7.2中看到，灰黄霉素变种B-53，经过自然分离，获得的变株C-04的产量比前者显著提高。;三、单孢子（或单细胞）悬液的制备;12;3. 制备原生质体作诱变材料 以原生质体作为材料进行诱变有以下几个方面的优点： （1）在丝状真菌中，由于菌丝有不同程度的分化，去壁后的原生质体是异质的，即各原生质体的生理、生化、分化程度等相异，为育种提供了各式各样的诱变原材料，增加了突变的可能性。 （2）微生物细胞具有细胞壁，其中的一些成分，如黑色素会吸收紫外线、γ射线和X射线的能量，进而减缓了这些因子对细胞的损伤作用，降低了诱变效果。 （3）有些丝状菌在一般培养条件下不产生孢子，育种时只能以多核菌丝体及碎片作为材料。用这些材料进行诱变，往往因遗传分离而产生不纯或不稳定现象。对这类微生物采用原生质体作为诱变材料，可能会增强诱变效应。;四、诱变剂及诱变剂量 （一）诱变剂种类的选择 1.选择诱变剂 诱变剂主要对DNA分子上基因的某一位点发生作用。根据诱变剂作用机制，再结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂进行诱变。 例如，灰黄霉素野生菌使用氯化锂和紫外线，取得惊人诱变效果；头孢菌素C产生菌有效的诱变剂是紫外线、氯化锂、甲基磺酸乙酯；博莱霉素、四环素族产生菌常用一些具有氨基、硝基、亚硝基还原性质的亚硝酸、羟胺、氯化锂等诱变剂，突变率较高；青霉素生产菌以亚硝基胍、氮芥、乙烯亚胺等具有活泼烷化基团的烷化剂更为适合。;2.根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂 对遗传稳定的出发菌株 最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，使DNA结构发生严重损伤，造成大的变异，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理； 对遗传性不稳定的出发菌株