基因工程与基因体外表达培训课件.pptxVIP

第13章基因工程与基因体外表达Genetic Engineering and gene expression in vitro重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验1977年，基因工程产品的出现 H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)1997年,动物克隆: 克隆羊多莉 2001年，人类基因组计划一、重组DNA技术相关概念（一） DNA克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。 目的：① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）目的基因的获取克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接DNA导入受体细胞重组体的筛选克隆基因的表达 重组DNA技术基本原理基本原理第一节基因克隆是利用工具酶进行操作关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：基因的剪刀——限制酶基因的针线——DNA连接酶基因的运载工具——运载体工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶GCCTAGGGATCCCCTAGGGATCC G限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 定义：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。Bam HⅠ+分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。 属 系 株 序命名：Hin dⅢHaemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) GGATCCCCTAGG切口 ：平端切口、粘端切口II型限制性核酸内切酶： 能识别DNA分子内部的特异性位点和切割双链DNA， 其切割位点的序列可知、固定。GGATCCCCTAGGGTCGACCAGCTGGCCTAGGATCC GGTCCAGGACCTGHindⅡBam HⅠ++平端切口粘端切口GCCTAGGCCTAGGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGATCC GGATCC G同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。Bam HⅠ+BstⅠ+ AGATCT TCTAGA GGATCC CCTAGG GATCC GATCTAG GATCT AGCCTAG 同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。Bg lⅡBam HⅠ++ 限制性内切核酸酶名　　称　　 　识别序列及切割位点名　　称　　　　　识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’Bgl Ⅱ 5’…A▼GATCT...3’EcoR Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’Hind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’…▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出