DNA的复制与重组课程.pptx

;一，DNA的复制;*; 现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点—— 在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位， 而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。 从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。;2 DNA的半保留复制; 半保留复制实验依据 1958年M.Messelson 等用实验予以了证实 双螺旋结构是半保留复制的分子基础 ;3 DNA的半不连续复制;（以原核生物 大肠杆菌为例） 1. 原料： dNTP，Mg++ 2. 双链DNA模板 3. 引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游离的 3’OH。 4. 引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物 5. 解螺旋酶 ( helicase ) , DnaB, 由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（Ori C）上解开双螺旋。; 单链结合蛋白（SSB，single stranded binding protein）稳定已经解开成两股的DNA单链，防止其退火复性。 7. 拓扑异构酶(DNA topoisomerase) DNA 分子中存在打结，缠绕、连环的超螺旋现象。 I 型酶： 切开双链中的一股，使DNA不致打结，切口的3’端可通过自由转动一周再与5’端磷酸连接，不需ATP。 II 型酶：切断处于超螺旋状态中双股链中的某个部位，通过切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢复复制所要求的负超螺旋状态。 (注: 拓扑一词的含义是指物体或图象作弹性移位而又保持物体不变的性质。) ;8. DNA聚合酶（DNA polymerase）;聚合酶 I 用于切除引物RNA,并填补留下的空隙 有从5’——3’ 延伸多核苷酸链的聚合酶的活性； 有从3’——5’ 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸； 有从5’——3’ 外切酶的活性，其作用是切除引物 聚合酶II 活性弱,作用与聚合酶III相似 有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性； 有从3’——5’ 外切酶的活性 ; 真核的DNA聚合酶 真核DNA的复制至少涉及5种复制酶α、β、γ、δ和ε，其中α、δ、ε参与染色体DNA的复制。 α有引物要求； β负责DNA的修复； γ的功能是线粒体DNA的复制。 ;9. DNA连接酶（ligase）;5 原核生物DNA的复制;In 1963, John Cairns’ Technique: Grew E. coli in 3H thymidine Waited till cells were in the middle of replication Lysed the cells very very gently Spread the lysate on an EM grid Exposed the grid to X-ray film for TWO months.;What Cairns’ experiment (1963) showed:;大肠杆菌(E. coli)的 OriC 复制原点;复制的起始;大肠杆菌DNA复??的步骤;复制的延伸;复制的终止;6 真核生物DNA的复制;真核生物DNA的复制特点;真核生物DNA的复制子被称为ARS (autonomously replicating sequences)，长约150bp左右，包括数个复制起始必需的保守区。; 真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp/秒。 因此，人类DNA中每隔30,000-300,000bp就有一个复制起始位点。;已发现的真核生物DNA聚合酶有15种以上。 在哺乳动物细胞中主要有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε 。;真核生物DNA聚合酶的特性比较;DNA聚合酶α主要参与引物合成。;RF-C is a five-subunit complex All subunits are related in sequence and have ATP binding motifs ATP hydrolysis by RF-C is associated with the loading of PCNA RF-C is the functional homolog of the clamp-loader g complex;Polymerase switching occurs even on l