集中生化大实验生化大实验.pptVIP

沉降系数:根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 S = （1/ω2X）·（dx/dt）= d2（ρp-ρm）/18η 1S=10-13秒 式中,d为球形粒子直径；η为流体介质的粘度； ρp为粒子的密度； ρm为介质的密度。 从该式中可看出， （1）当ρp ρm，则SO，粒子顺着离心方向沉降。 （2）当ρp =ρm ，则S= 0，粒子到达某一位置后达到平衡。 （3）当ρp ρm ，则SO，粒子逆着离心方向上浮。 ;2.1差速沉降离心法 ;;2.2密度梯度区带离心法 ： ;2.2.1差速区带离心法： 不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。 此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。 ; 离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大 但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。;2.2.2等密度离心: 离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。 此密度梯度包含了被分离样品中所有粒子的密度。 当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在管顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。 定义：离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带。 ;;此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。 提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。;四种血浆脂蛋白的比重：; 此次是将血浆预先与梯度介质混合后装入离心管，通过离心将整个液体形成梯度,在强大离心力作用下各脂蛋白依其自身密度不同而分散于相应的离心管中的密度梯度同一密度层，从而达到分离纯化的目的。 ;[操作步骤] 1．血浆准备：取血库血浆250mL 。 2．CM和VLDL分离： 1）取约250ml血浆调密度至 1.019g/mL，分置于离心管中，加盖，用密度1.019g/mL液平衡，放入RP50T转头，在8℃下40000rpm，离心时间20小时， CM和VLDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。; 3．LDL分离： 下层溶液加入适量的NaBr，调节密度至1.063g/mL，分置于离心管中，加盖，用密度1.063g/mL液平衡，放入RP50T转头，在8℃下40000rpm，离心时间20小时， 浮于离心管上层，用吸管小心吸取。;[实验器材]: 1.超速离心机：转速50000~80000rpm，RCF可达600000g；离心容量由几十ml至2L，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，可进行亚细胞器分级分离，病毒、核酸、蛋白质和多糖等生物大分子的分离。 ;;2.角式转头：离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有4～12个装离心管用的孔，孔的中心轴与旋转轴间有20～40°夹角，角度越大沉降越结实，分离效果越好。;角转头的优点：容量较大、重心低、运转平衡、寿命较长。是各种离心机的最高速转头。 缺点：由于颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积而产生“壁效应”，壁效应易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱而影响分离效果。;;3. 离心管: 主要用塑料和不锈钢制成 塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 管盖有三种作用： ①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。 ②防止样品挥发。 ③支持离心管，防止离心管变形。;4.梯度材料: 卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。;《超速离心机使用注意事项》： 1 ．超速离心机由专人保管专人使用，非保管