32章rna的生物合成和加工6.pptVIP

①模板DNA（单链） ②引物 ③DNA聚合酶 ④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP ⑤一定浓度的Mg2+ 合成方向：5 ’ → 3’端 ? 化学合成：方向3’ → 5’，不需酶和DNA模板。 生物合成：方向5’ → 3’，需模板、引物和酶。 专题: DND 及cDNA体外合成技术 一、 DNA的酶合成 Denature Annealing Elongation 反应物 （1）模板 单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板，若以RNA为起始材料，则须经反转录，获得第一条cDNA后才能用于PCR。 （2）Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键，从水生栖热菌（Thermus aquaticns VT-1）分离出来。 Taq DNA聚合酶有很好的热稳定性，92.5℃处理130min，仍保留50%的酶活性，在68-74℃活性最高，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。 （3）引物 引物是决定PCR结果的关键，它由寡核苷酸组成，15-30 b （4）核苷酸dNTP dNTP的浓度50-200 umol/L。 （5）镁离子Mg2+????? 2.PCR原理? 变性 95℃ 复性 55℃ 延伸 72℃ PCR（Polymerase Chain Reaction） 引物： 特异性反应的关键，知道任何一段模板DNA序列-设计引物。 设计引物： ①引物长度： 15-30bp，常用为20-25bp左右。 ②引物扩增跨度： 特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，太少--扩增效果不佳，过 多--非特异条带，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体； ⑤引物3‘端的碱基（最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，末端碱基不配对--PCR失败。 ⑥引物（可加合适的酶切位点--酶切分析或分子克隆）。 ⑦引物的特异性：与其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.1～1??mol或10～100 pmol，偏高--错配和非特异性扩增；增加引物之间形成二聚体的机会。 载体构建:引物可加酶切位点序列如AGAATTCATGGCTAACGTGCAATGCGTA vector gene 二、 cDNA体外合成技术 1. cDNA文库的构建 cDNA文库：以总mRNA为模板，用反转录酶合成第一链，去除mRNA，合成第二链。从而得到特定细胞中所有mRNA对应的cDNA。 cDNA文库是获得真核结构基因的最好方法，成熟的mRNA无内含子。是分离鉴定新基因和功能基因组研究的重要工具之一。 2. cDNA文库的构建过程 ①真核mRNA的特点和纯化 特点1：含量少，表达具有发育阶段性 和组织特异性。 总RNA： rRNA 80~85% mRNA 1~5% tRNA及其它小分子RNA 10~15% 特点2： 不均一。在1~5%的mRNA中，有10000-30000 mRNA种。 分离、纯化： 用Oligo dT纤维素柱（亲和层析法），加入总RNA，高盐洗脱，先流出非mRNA。降低盐浓度，加入Oligo dT竞争，可洗出mRNA 混合物。 ②cDNA合成 A. 引物合成法 Oligo(dT)15-18个核苷酸。 mRNA5’端序列有丢失。 B. 取代合成法（较常用）? Oligo（dT）与mRNA3’端poly (A)杂交作为引物，合成第一条DNA链。 RNaseH在mRNA上产生多个切口。 DNA pol.Ⅰ切口平移，DNA ligase连接，合成出第二条DNA链。 T4DNA pol.切去端头的RNA-DNA杂交链。 取代合成法 ③ cDNA与载体连接 ④ 重组体的转化 ⑤ 扩增、保存 RT-PCR注意事项： 1) 防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 2) 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 3) 内参的设定：用于靶RNA的定量。常用的内参β-Actin（β-肌动蛋白）等。避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 4) PCR不能进入平台期，对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。 5) 防止DNA的污染：